小麥胚芽是小麥制粉過(guò)程中的主要副產(chǎn)物，營(yíng)養價(jià)值豐富，其中高含量的蛋白質(zhì)以及不飽和脂肪酸讓小麥胚芽可作為蛋白補充劑與糧油制品的理想原料。但由于小麥胚芽中存在高活性的內源脂肪氧化酶、高含量的抗營(yíng)養因子以及高水分活度，使得小麥胚芽難以直接作為食品加工原料得到有效利用，往往被作為飼料或廢料處理。發(fā) 酵作為改良食品理化及加工特性的有效方法，在小麥胚芽上也得到了成功應用。發(fā)酵后的小麥胚芽中的植酸等抗營(yíng)養因子的含量大大減少，脂肪酶和脂肪氧化酶的活性也得到顯著(zhù)抑制。研究還發(fā)現，小麥胚芽中的活性肽、多酚等功能活性物質(zhì)的含量也在發(fā)酵后顯著(zhù)增加，具有降血脂、抗氧化、抗腫瘤等生理功能]。其中2,6-二甲氧基對苯醌（2,6-dimethoxy-ρ-benzoquinone，2,6-DMBQ）作為發(fā)酵小麥胚芽中主要的抗腫瘤活性成分而受到廣泛關(guān)注。

2,6-DMBQ來(lái)源于小麥胚芽細胞內的水溶性氫醌糖苷。在發(fā)酵過(guò)程中，氫醌糖苷的糖苷鍵受微生物分泌的β-葡萄糖苷酶的作用斷裂，并在過(guò)氧化氫酶的作用下生成2,6-DMBQ[13]。HIDV魪GI M等[14]在20世紀90年代利用面包酵母發(fā)酵小麥胚芽，對發(fā)酵產(chǎn)物加工后得到發(fā)酵小麥胚芽提取物并命名為Avemar。在后續的研究中，Avemar的抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力的功效得到廣泛證實(shí)，但對于A(yíng)vemar具體的發(fā)酵工藝與發(fā)酵菌種卻鮮有報道。國內學(xué)者經(jīng)秀等]和國外學(xué)者RIZZELLO C G等[18]分別以酵母菌和乳酸菌為受試菌種進(jìn)行產(chǎn)2,6-DMBQ菌種的篩選，最終得出高溫釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和植物乳桿
菌（Lactobacillus plantarum）為最適發(fā)酵菌種，但是后續并沒(méi)有對兩種菌種產(chǎn)2,6-DMBQ的能力進(jìn)行進(jìn)一步比較。

本研究以小麥胚芽為原料，2,6-DMBQ產(chǎn)量為評價(jià)指標，從3株菌株中篩選最優(yōu)發(fā)酵菌種，并考察3種原料前處理方式對2,6-DMBQ產(chǎn)量的影響。在此基礎上，探究菌種添加量、料液比、發(fā)酵溫度以及發(fā)酵時(shí)間4個(gè)發(fā)酵工藝因素對2,6-DMBQ產(chǎn)量的影響，并通過(guò)單因素試驗及正交試驗確定最適合發(fā)酵工藝組合，旨在為發(fā)酵小麥胚芽資源進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

小麥胚芽：市售。

1.1.2 菌種

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）：實(shí)驗室分離保存；高溫釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、低糖面包酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.1.3 試劑

甲醇、氯化鈉（均為分析純）：國藥集團上海試劑有限公司；2,6-二甲氧基對苯醌標準品（純度>97%）：梯希愛(ài)上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基、孟加拉紅培養基、MRS肉湯培養基、MRS固體培養基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

RS-FS1401型多功能粉碎機：合肥榮事達小家電有限公司；LHS-250HC-11型恒溫恒濕培養箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BSA 124S型精密分析天平：廣州市授科儀器科技有限公司；Avanti J-26xp型高速離心機：美國B(niǎo)eckman公司；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗設備有限公司；KQ-700DE型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；LDZM-80L-III型滅菌鍋：上海申安醫療器械廠(chǎng)；LGJ-25G冷凍干燥機：北京四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展有限公司；M3-L233B微波爐：廣東美的微波爐制造有限公司；Waters ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色譜系統：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 小麥胚芽發(fā)酵工藝及操作要點(diǎn)

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?菌種活化
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?↓
小麥胚芽→粉碎→滅菌→預處理→接種→發(fā)酵

操作要點(diǎn)：

粉碎：將小麥胚芽粉碎后，過(guò)60目篩。滅菌：將小麥胚芽粉與超純水按質(zhì)量比1∶3充分混勻后在121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌15 min。預處理：將滅完菌的小麥胚芽與超純水按照質(zhì)量比1∶10再次混勻，按照后續試驗設計進(jìn)行不同處理。菌種活化、接種：將植物乳桿菌接入MRS肉湯，37 ℃條件下培養24 h，取200 μL培養液接入MRS肉湯培養基，37 ℃條件下培養24 h，連續活化培養2代后，按后續試驗設計進(jìn)行接種。高溫釀酒酵母和低糖面包酵母在37 ℃溫水中活化10 min后取200 μL接入YEPD培養基，28 ℃條件下培養24 h，連續活化培養2代后，按后續試驗設計進(jìn)行接種。發(fā)酵：按照后續試驗設計分別在不同條件下進(jìn)行發(fā)酵。

1.3.2 發(fā)酵菌種的篩選

植物乳桿菌：用無(wú)菌生理鹽水將活化后的植物乳桿菌菌體濃度調節至1×10⁴ CFU/mL，按菌種添加量1∶6（菌液與麥胚質(zhì)量比，g∶g）添加到料液比為1∶15（麥胚與水質(zhì)量比，g∶g）的小麥胚芽發(fā)酵基液中，37 ℃條件下發(fā)酵24 h。

酵母：用無(wú)菌生理鹽水將活化后的高溫釀酒酵母、低糖面包酵母的菌體濃度調節至1×10⁴ CFU/mL，按菌種添加量1∶6分別添加到料液比為1∶15的小麥胚芽發(fā)酵基液中，28 ℃條件下發(fā)酵24 h。

?取發(fā)酵液測定2,6-DMBQ產(chǎn)量，比較3株菌產(chǎn)2,6-DMBQ的能力，確定最適發(fā)酵菌種。

1.3.3 不同預處理方式對2,6-DMBQ產(chǎn)量的影響

在確定最適發(fā)酵菌種的基礎上，以未作處理的小麥胚芽為空白對照，根據前期預試驗結果，分別采用高溫（95 ℃，30 min）、微波（700 W，5 min）、超聲（功率100%，30 min）3種方法對小麥胚芽進(jìn)行預處理。用無(wú)菌生理鹽水將活化后的最適菌種的菌體濃度調節至1×104 CFU/mL，按菌種添加量1∶6添加到料液比為1∶15的小麥胚芽發(fā)酵基液中，28 ℃條件下發(fā)酵24 h。測定發(fā)酵液中2,6-DMBQ產(chǎn)量，以探究不同的預處理條件下是否有助于2,6-DMBQ產(chǎn)量的增加，確定最適預處理方式。

1.3.4 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

在確定最適發(fā)酵菌種和預處理方式后進(jìn)行發(fā)酵條件的研究，固定發(fā)酵條件為：菌種添加量1∶6、料液比1∶15、發(fā)酵時(shí)間24 h、發(fā)酵溫度28 ℃，在此基礎上，依次考察菌種添加量（1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、 1∶25）、發(fā)酵溫度（18 ℃、23 ℃、28 ℃、33 ℃、38 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（18 h、24 h、30 h、36 h、42 h）對2,6-DMBQ產(chǎn)量的影響，確定
各因素的最適條件以進(jìn)行正交試驗。

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

根據單因素試驗結果，以2,6-DMBQ產(chǎn)量為評價(jià)指標，選取菌種添加量（A）、料液比（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、發(fā)酵溫度（D）4個(gè)因素進(jìn)行4因素3水平的L（9 34）正交試驗設計，以確定最佳發(fā)酵條件組合，正交試驗因素與水平見(jiàn)表1。

1.3.6 2,6-DMBQ產(chǎn)量的測定

樣品的處理：將發(fā)酵液在8 000×g、4℃條件下離心15 min，取上清液冷凍干燥，然后加入20 mL甲醇于凍干物料中進(jìn)行浸提，超聲處理（功率100%，30 min）后，用0.22 μm濾膜過(guò)濾制得待測樣品液進(jìn)行測定。

參照經(jīng)秀等[17]的方法進(jìn)行了改進(jìn)，采用超高效液相色譜（ultra performance liquidchromatography，UPLC）法測定2,6-DMBQ產(chǎn)量。UPLC條件：ACQUITY UPLC BEH C18色 譜柱（2.1 mm×100 mm1.7 μm），流動(dòng)相為甲醇∶水=20∶80（V/V），流速0.2 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量0.2 μL，檢測波長(cháng)
288 nm。以2,6-DMBQ的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y） 為縱坐標，繪制2,6-DMBQ標準曲線(xiàn)。2,6-DMBQ標準曲線(xiàn)的回歸方程為y=48 102x-33 772，R²=0.999 4，說(shuō)明2,6-DMBQ在1～100 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，可用于2,6-DMBQ的定量。根據2,6-DMBQ標準品的保留時(shí)間進(jìn)行定性。