聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHAs)是一類(lèi)由羥基脂肪酸單體通過(guò)酯化聚合得到的高分子化合物，因具有傳統石油基塑料類(lèi)似的力學(xué)特征、100%生物降解性和生物相容性而被認為是最有潛力的綠色環(huán)保材料之一。受限于其高昂的生產(chǎn)成本，PHAs作為綠色環(huán)保材料的應用推廣困難。文中分別從細胞形態(tài)調控、代謝途徑構建、廉價(jià)碳源利用和開(kāi)放式發(fā)酵技術(shù)開(kāi)發(fā)等方面詳細介紹了目前有效降低PHAs生產(chǎn)成本的方法。盡管大部分研究成果還局限于實(shí)驗室階段，但是研究方法和方向為實(shí)現低成本PHAs的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論指導。

聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHAs)是一類(lèi)由羥基脂肪酸單體通過(guò)酯化聚合得到的高分子化合物，是微生物在特定環(huán)境下的能量?jì)湮镔|(zhì)。隨著(zhù)白色污染加重和石油資源枯竭，具有傳統石油基塑料相似的力學(xué)特征、100%生物降解性和生物相容性的PHAs被認為是最有前景的綠色環(huán)保材料之一。目前只有少數工廠(chǎng)，例如德國B(niǎo)iomer Inc.、美國P&G、巴西PHB Industrial和中國Tianan Biologic等實(shí)現了PHAs的中試級別生產(chǎn)，但產(chǎn)量遠遠無(wú)法滿(mǎn)足市場(chǎng)需求。主要原因是PHAs高昂的生產(chǎn)成本(2.2–5.0歐元/kg)大大限制了其作為綠色環(huán)保材料的應用。本文首先介紹了PHAs的類(lèi)型和合成代謝途徑，隨后從細胞形態(tài)調控、代謝途徑構建、廉價(jià)碳源利用和開(kāi)放式發(fā)酵技術(shù)開(kāi)發(fā)等方面詳細介紹了不同研究團隊在降低PHAs生產(chǎn)成本方面的研究成果，以期為實(shí)現低成本PHAs的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導。

1 PHAs簡(jiǎn)介

1.1 PHAs分類(lèi)

根據單體碳原子數PHAs可以分為短鏈PHAs(Short-chain-length，SCL)和中長(cháng)鏈PHAs (Mediumlong-chain-length，MCL)，根據單體不同排列方式又可以分為均聚物(Homo polymer)、無(wú)規共聚物(Random copolymer)和嵌段共聚物(Block copolymer)。超過(guò)150種羥基脂肪酸可以作為PHAs合成的單體，其多元化組合賦予了PHAs性能的多樣性，例如SCL PHAs材料堅硬易碎，MCL PHAs材料韌性良好，按照不同比例混合后的共聚物表現出不同的硬度和韌性，這為開(kāi)發(fā)不同特性的產(chǎn)品提供了無(wú)限可能。

第一代商業(yè)PHAs，聚-3羥基丁酸酯(Polyhydroxybutyrate，PHB)是3-羥基丁酸(3HB)的均聚物，也是發(fā)現最早、研究最深入的PHAs材料。因為其良好的抗氧化性、防水性和較高的硬度，PHB材料主要被開(kāi)發(fā)用作包裝材料。但是它較脆的材質(zhì)和接近降解溫度(220℃)的熔解溫度(175℃)不利于熱加工處理。第二代商業(yè)PHAs是由3HB和3-羥基戊酸(3HV)無(wú)規則共聚而成的聚3-羥基丁酸-3-羥基戊酸酯(Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)，P(3HB-co-3HV))。

相比于PHB，P(3HB-co-3HV)在熱加工性能、韌性和延展性方面均得到了提高。第三代商業(yè)PHAs是由3HB和中鏈3-羥基己酸(3HHx)無(wú)規則共聚合成的聚-3-羥基丁酸-3-羥基己酸(Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)，P(3HB-co-3HHx))。3HHx的混入給予了材料優(yōu)異的彈性體性能和生物相容性能，因而被開(kāi)發(fā)用作生物醫用材料。隨著(zhù)PHAs研究的進(jìn)一步發(fā)展，研究人員預測P(3HB-co-4HB)將會(huì )成為第四代商業(yè)PHAs，4HB的混入成功克服了PHB質(zhì)地脆弱的缺點(diǎn)。目前PHAs已經(jīng)用于塑料工業(yè)的包裝材料、農業(yè)的農膜材料以及醫藥領(lǐng)域的組織工程和藥物緩釋材料等的加工生產(chǎn)中。

1.2 PHAs合成代謝途徑

超過(guò)90個(gè)屬的500種細菌具有PHAs合成能力，其中PHAs合成代謝途徑主要有3條(圖1，紅色部分)。途徑Ⅰ：從糖酵解途徑(EMP)生成的兩分子乙酰Co A (Acetyl-Co A)依次經(jīng)β-酮基硫解酶(Pha A)和乙酰乙酰Co A還原酶(Pha B)，最后在PHA合酶(Pha C)催化下合成PHB。途徑Ⅱ：同樣以乙酰Co A為起點(diǎn)的脂肪酸從頭合成途徑(de novo synthesis)的中間產(chǎn)物參與PHAs的合成。該途徑的關(guān)鍵酶3-羥基酯酰ACP-Co A轉移酶(Pha G)將R-3-羥基酯酰ACP (R-3-hydroxyacylACP)轉化為R-3-羥基酯酰Co A (R-3-hydroxyacylCo A)，從而被Pha C催化合成PHAs。途徑Ⅲ：脂肪酸被活化成酯酰Co A后進(jìn)入β-氧化(β-oxidation)途徑，中間產(chǎn)物S-3-羥基酯酰Co A(S-3-hydroxyacyl-Co A)在差向異構酶作用下轉換成可以被Pha C催化利用的R-3-羥基酯酰Co A。盡管部分微生物利用脂肪酸合成PHB，但是其主要利用β-氧化途徑生成的乙酰Co A通過(guò)途徑Ⅰ合成。

除這3條主要途徑外，微生物體內還存在其他PHAs合成途徑，以及通過(guò)基因工程構建的新的PHAs合成途徑(圖1，藍色部分)。例如從草酰乙酸(Oxaloacetate)出發(fā)，通過(guò)基因工程手段為P(3HB-co-3HV)的合成提供3-羥基戊酰Co A (3-hydroxyvaleryl-Co A，3HV)；從琥珀酰Co A (Succinyl-Co A)出發(fā)為P(3HB-co-4HB)合成提供4-羥基丁酰Co A (4-hydroxybutyryl-Co A，4HB)等。

2 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)低成本PHAs

PHAs的生產(chǎn)成本集中在發(fā)酵物料的消耗和滅菌過(guò)程的能源消耗上，其中前者占成本的50%，后者占30%?；诖?，各個(gè)研究團隊希望通過(guò)降低發(fā)酵物料成本和滅菌過(guò)程能源消耗成本來(lái)降低PHAs的生產(chǎn)成本。例如提高菌株產(chǎn)率、利用廉價(jià)物料以及開(kāi)發(fā)開(kāi)放式發(fā)酵技術(shù)等。

2.1 細胞形態(tài)調控及代謝途徑構建

作為胞內代謝產(chǎn)物，當鹽單胞菌Halomonas campaniensis LS21內PHAs充滿(mǎn)細胞體積時(shí)也僅達到生物量的60%，這表明PHAs積累量嚴重受限于細胞體積。研究人員發(fā)現通過(guò)抑制細胞分裂蛋白Fts Z，由桿狀轉變?yōu)榻z狀形態(tài)的重組大腸桿菌E.coli Trans1T1的PHB占比增加了125%。隨后，Wu等發(fā)現基因min CD和細胞骨架蛋白Mer B也具有抑制細胞分裂和調控細胞形態(tài)的作用，重組大腸桿菌E.coli JM109內的PHB積累量達到生物量的80%?；騧in CD和fts Z在PHAs生產(chǎn)菌株中同樣具有影響細胞分裂和形態(tài)的作用。過(guò)表達min CD的重組鹽單胞菌Halomonas TD08在靜置培養下長(cháng)成數百微米的絲狀菌體，PHB含量從68.69%提升至82.04%，即使在振蕩培養下菌絲長(cháng)度依然是出發(fā)菌株的1.4倍。

為了解決Fts Z和Mer B非正常表達后細胞數量減少的問(wèn)題，Jiang等構建了溫度敏感表達質(zhì)粒，菌體在30℃時(shí)正常生長(cháng)到預定生物量后升高至37℃，Fts Z和Mer B表達受限，菌體細胞膜剛性遭到破壞、細胞分裂受到抑制，從細桿狀轉向粗絲狀的菌體可以實(shí)現更多PHAs的積累。這一舉措既實(shí)現了發(fā)酵前期生物量積累、發(fā)酵后期菌體存儲空間增大的目的，又消除了基因工程手段對發(fā)酵前期細胞生長(cháng)的負面影響。

除了形態(tài)調控，基因工程還適用于構建中間物的合成代謝途徑。大部分菌株需利用多種碳源合成共聚物PHAs，例如在培養基中同時(shí)提供葡萄糖和丙酸才能獲得共聚物P(3HB-co-3HV)。為了解決這個(gè)問(wèn)題，Tan等強化蘇氨酸合成途徑的同時(shí)敲除2-甲基檸檬酸合酶，胞內丙酰Co A濃度上升，重組鹽單胞菌TD01實(shí)現了單一碳源下P(3HB-co-3HV)的生物合成。同樣的，在單一碳源下，Li等通過(guò)敲除琥珀酸半醛脫氫酶基因和過(guò)表達orf Z，胞內碳通量流向4HB-Co A的合成，為共聚物P(3HB-co-4HB)的合成提供前體。構建中間物的合成代謝途徑，一方面避免了使用其他脂肪酸導致的原料成本增加和可能帶來(lái)的毒性作用，另一方面為利用微生物直接合成多種類(lèi)PHAs提供了指導方向。

聲明：本文所用圖片、文字來(lái)源《生物工程學(xué)報》2021年2月，版權歸原作者所有。如涉及作品內容、版權等問(wèn)題，請與本網(wǎng)聯(lián)系

相關(guān)鏈接：脂肪酸酯，3羥基丁酸酯，草酰乙酸，琥珀酸