核酸探針（Nucleic acid prode）是指帶有檢測標記的已知核苷酸片段，能與互補核苷酸序列退火雜交，并可以被特殊的方法所探知。因此可以用于待測核酸樣品中特定基因序列的探測。

核酸分子雜交的基本原理是：具有一定同源性的兩條核苷酸單鏈在一定條件下（適宜的溫度及離子強度等），可按堿基互補原則退火形成雙鏈，此雜交過(guò)程是高度特異性的。核酸分子雜交發(fā)生于兩條DNA單鏈之間者（ssDNA：ssDNA）稱(chēng)。DNA雜交；發(fā)生于RNA鏈與DNA鏈單鏈之間者（RNA：ssDNA）稱(chēng)RNA：DNA雜交。

因此，如果把一段已知基因（DNA或RNA）的核苷酸序列用合適的標記物（放射性同位素、熒光色素、生物素和地高辛等）標記，當作探針與變性后的單鏈基因組DNA進(jìn)行雜交反應，并用合適的方法（如放射自顯影技術(shù)或免疫組織化學(xué)技術(shù)）把標記物檢測出來(lái)，如果兩者的堿基完全配對，它們即結合雙鏈，從而表明被測基因組DNA中含有已知的基因序列（同源序列或片段）；檢測不出結合則不含已知序列。

該項技術(shù)不僅具有特異性、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，而且兼備組織化學(xué)染色的可見(jiàn)性和定位性，從而能夠特異性地顯示細胞的DNA或RNA，從分子水平去研究特定生物有機體之間是否存在著(zhù)親緣關(guān)系，并可揭示核酸片段中某一特定基因的位置。目前這項技術(shù)，已被廣泛應用于分子生物學(xué)領(lǐng)域。

近年來(lái)，隨著(zhù)食品微生物檢測技術(shù)的發(fā)展，核酸探針技術(shù)已被越來(lái)越多地用于食品中沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌等食源性病原菌的快速檢測。

根據核酸分子探針的來(lái)源及其性質(zhì)可分為基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針及人工合成的寡核苷酸探針等。

一、基因組DNA探針

這類(lèi)探針多采用分子克隆從基因文庫篩選或用PCR技術(shù)擴增制備。由于真核生物基因組中存在高度重復序列，制備探針應盡可能選用基因的編碼序列（外顯子），避免選用內含子及其他非編碼序列，否則將引起非特異性雜交而出現假陽(yáng)性結果。

二、cDNA探針

cDNA探針是以RNA為模板，在反轉錄酶的作用下合成的互補DNA，因此它不含有內含子及其他非編碼序列，是一種較理想的核酸探針。cDNA探針包括雙鏈cDNA探針和單鏈DNA探針。

雙鏈cDNA探針的制備方法是首先從細胞內分離出mRNA，然后通過(guò)逆轉錄合成cDNA，再通過(guò)DNA聚合酶合成雙鏈cDNA分子。將雙鏈cDNA分子插入載體中克隆、篩選、擴增、純化，然后進(jìn)行標記即可。

單鏈DNA探針的制備相對來(lái)說(shuō)要簡(jiǎn)單些，即將cDNA導人M13衍生載體中，產(chǎn)生大量單鏈jDNA，標記后即成。用單鏈DNA探針雜交，可克服雙鏈cDNA探針在雜交反應中的兩條鏈之間復性的缺點(diǎn)，使探針與靶mRNA結合的濃度提高，從而提高雜交反應的敏感性。

三、RNA探針

mRNA作為核酸分子雜交的探針是較為理想的，其優(yōu)點(diǎn)是：①RNA／RNA和RNA／DNA雜交體的穩定性較DNA／DNA雜交體的穩定性高，因此雜交反應可以在更為嚴格的條件下進(jìn)行（雜交溫度可提高10℃左右），雜交的特異性更高；②單鏈RNA分子由于不存在互補雙鏈的競爭陛結合，其與待測核酸序列雜交的效率較高；③RNA中不存在高度重復序列，因此非特異性雜交也較少；④雜交后可用RNase將未雜交的探針?lè )肿酉?，從而使本底降低?/p>

但是，大多數mRNA中存在多聚腺苷酸尾，有時(shí)會(huì )影響其雜交的特異性，此缺點(diǎn)可以通過(guò)在雜交液中加入Poly（A），將待測核酸序列中可能存在的Poly（dT）或Poly（u）封閉而加以克服。另外，RNA極易被環(huán)境中大量存在的核酸酶所降解，因此不易操作也是限制其廣泛應用的重要原因之一。事實(shí)上，極少使用真正的mRNA作為探針，因為其來(lái)源極不方便，一般是通過(guò)cDNA克隆，甚至基因克隆經(jīng)體外轉錄而得到mRNA樣或anti-mRNA樣探針。

制備的RNA探針?lè )椒ㄊ?，首先把目的基因cDNA片段插入到含有特異的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒中，再將重組質(zhì)粒擴增、純化，用限制酶將質(zhì)粒模板切割，使之線(xiàn)性化，然后在RNA酶的作用下，從啟動(dòng)子部位開(kāi)始，以cDNA為模板進(jìn)行體外轉錄。在體外轉錄反應體系中，只要提供有標記的核苷酸原料，經(jīng)過(guò)體外轉錄后就能獲得標記的RNA探針。

四、寡核苷酸探針

采用人工合成的寡聚核苷酸片段作為分子雜交的探針，其優(yōu)點(diǎn)是可根據需要隨心所欲地合成相應的序列，避免了天然核酸探針中存在的高度重復序列所帶來(lái)的不利影響；由于大多數寡核苷酸探針長(cháng)度只有15～30bp，其中即使有一個(gè)堿基不配對也會(huì )顯著(zhù)影響其熔解溫度（t_m），因此它特別適合于基因點(diǎn)突變分析；此外，由于序列的復雜性降低，因此雜交所需時(shí)間也較短。

需要注意的是，短寡核苷酸探針所帶的標記物較少，特別是非放射性標記時(shí)，其靈敏度較低，因此當用于單拷貝基因的Southern印跡雜交時(shí)，采用較長(cháng)的探針為好。

寡核苷酸探針是以核苷酸為原料，通過(guò)DNA合成儀合成的。合成寡核苷酸探針的長(cháng)度一般為10～50個(gè)核苷酸。如果靶DNA或mRNA的序列是已知的，合成寡核苷酸的序列就很容易確定。如果僅僅知道氨基酸的序列，由于遺傳密碼的兼并性，一個(gè)氨基酸兼有幾個(gè)密碼子編碼，如以氨基酸順序推測核苷酸順序，則可能與天然基因不完全一致，因此探針的設計就復雜得多。

在確定寡核苷酸序列時(shí)，一定要使該探針與靶基因序列特異性結合，而與無(wú)關(guān)序列不產(chǎn)生雜交反應。目前有專(zhuān)門(mén)的計算機軟件幫助設計合成寡核苷酸探針，可用5’末端標記法、3’末端標記法或引物延伸法標記寡核苷酸探針。

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