甜葉菊（SteviarebaudianaBertoni）屬多年生菊科草本植物，原產(chǎn)于南美洲和巴西的高山草甸，特別是南美巴拉圭東北部。甜葉菊中富含甜菊糖苷，被廣泛用作天然甜味劑。有研究報道從甜菊提取物中鑒定出89種化合物，并將其分為多酚類(lèi)化合物、萜類(lèi)化合物、氨基酸衍生物、脂肪酸及其衍生物類(lèi)、低聚糖、糖脂類(lèi)、嘌呤和維甲酸等。這些化合物具有多種生物活性，如抗氧化，抑菌，抗腫瘤等。甜菊提取物中的多酚和黃酮類(lèi)化合物具有很強的體外清除自由基的能力。然而，關(guān)于甜葉菊提取物體內抗氧化活性的研究鮮有報道。在生產(chǎn)甜菊糖苷的過(guò)程中會(huì )產(chǎn)生大量的絮凝廢渣，其中含有大量的多酚類(lèi)化合物，而這些副產(chǎn)物尚未得到充分利用。研究甜葉菊廢渣提取物的抗氧化、抗衰老作用，對充分開(kāi)發(fā)利用甜葉菊資源具有重要意義。

本研究采用高效液相色譜法（HPLC）對兩種甜葉菊廢渣提取物中的主要成分進(jìn)行定量分析，并測定其對D-半乳糖致衰老小鼠血清、肝臟和腦組織中一些重要的抗氧化指標（如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）和丙二醛（MDA），以及腦組織中Nrf2及其靶基因（SOD1，GPx1，HO-1）的mRNA表達水平的影響等，探討甜葉菊廢渣提取物對D-半乳糖致衰老小鼠的抗氧化作用，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應用提供理論依據。

一、材料與方法

1、試驗材料

兩種甜葉菊廢渣提取物，晨光生物科技集團股份有限公司。

2、實(shí)驗動(dòng)物

SPF級昆明種雄性小鼠（33～37g，SPF級，8周齡），軍事醫學(xué)科學(xué)院實(shí)驗動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號：SCXK-（軍）2012-0004。

3、主要試劑

D-半乳糖（分析純級），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；茶多酚（茶多酚＞88%、EGCG＞40%、兒茶素=0.76%），成都華高生物制品有限公司；咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮素、槲皮苷（純度均≧98%），成都瑞芬斯生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）、丙二醛（MDA）測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；BCA法蛋白定量試劑盒、高純總RNA快速提取試劑盒（離心柱型），北京百泰克生物技術(shù)有限公司；FastQuantcDNA第一鏈合成試劑盒（去基因組），天根生化科技（北京）有限公司；甲醇（色譜級），北京邁瑞達科技有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。

4、儀器與設備

Agilent1290超高效液相色譜，美國安捷倫科技有限公司；DY89Ⅱ勻漿機，寧波新芝生物科技有限公司；SpectraMax13連續波長(cháng)多功能酶標儀，美國MolecularDevices公司；3K15臺式離心機，德國Sigma公司；S1000PCR擴增儀、CFX96熒光定量PCR儀，美國伯樂(lè )公司；NanoDropTM2000微量紫外-可見(jiàn)光分光光度計，美國賽默飛世爾公司。

5、試驗方法

（1）兩種甜葉菊廢渣提取物中主要成分的定量分析

本實(shí)驗室研究人員前期研究證實(shí)，甜葉菊廢渣提取物的主要成分為咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮素和槲皮苷。采用HPLC法對兩種甜葉菊廢渣提取物中的主要成分進(jìn)行定量分析。高效液相色譜條件為：AgilentEclipsePlusC18色譜柱（50mm×2.1mm，1.8μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸（A）和甲醇（B），流速0.1mL/min。洗脫程序：0～10min，10%～50%（B）；10～12min，50%～10%（B）；12～15min，10%（B）。檢測波長(cháng)320nm和360nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量1μL。采用咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮素和槲皮苷為標準品，按上述色譜條件分別測定。以標準品的質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制HPLC標準曲線(xiàn)，并測定兩種甜葉菊廢渣提取物中各主要成分的含量。

（2）甜葉菊廢渣提取物對D-半乳糖致衰老小鼠的抗氧化作用

①小鼠飼養條件

小鼠飼養于北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，室內通風(fēng)條件良好，正常晝夜變化（9:00-21:00），相對濕度（40±5）%，室溫（21±2）℃。

②實(shí)驗分組及操作

80只實(shí)驗小鼠適應7d，喂食普通飼料，自由飲水、覓食。適應期后，隨機等分為正常組、D-半乳糖組、兩種甜葉菊廢渣提取物低、中、高劑量組（分別灌胃100，200，500mg/kgbw甜葉菊廢渣提取物），每組10只，同時(shí)用苦味酸對小鼠進(jìn)行編號。各組在灌胃的同時(shí)，D-半乳糖組和甜葉菊廢渣提取物組，頸背部皮下注射5%的D-半乳糖溶液（500mg/kgbw），正常組注射等體積的生理鹽水。每日給藥1次，持續時(shí)間為11周。

③待測樣本制備

實(shí)驗結束后，小鼠禁食（不禁水）11h。11h后，小鼠摘眼球取血，全血收集于干凈的1.5mL離心管中，37℃水浴15min，4000×g離心15min分離血清，-80℃保存待測。采血后，將小鼠斷頸處死并解剖，取出肝臟和腦組織并將其在預冷的生理鹽水中漂洗，去除血液，用濾紙吸干表面水分。將肝臟和腦組織一部分放入小離心管里，立即放入液氮（-196℃）中速凍，轉入超低溫冰箱（-80℃）存放，備用。另一部分剪碎，加入9倍0.9%預冷的生理鹽水，置玻璃勻漿器中冰水浴迅速研磨制成組織勻漿，4℃，12000×g離心15min，取上清液，-80℃保存備用。

④血清及組織抗氧化指標的測定

測定血清、肝和腦組織勻漿中SOD，GPx活力及MDA含量，檢測方法具體操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

⑤熒光定量PCR檢測小鼠腦mRNA表達水平

采用高純總RNA快速提取試劑盒提取各組小鼠腦組織中總RNA，使用NanoDropTM2000微量紫外-可見(jiàn)光分光光度計檢測其完整性及其濃度。按逆轉錄試劑盒操作說(shuō)明，將提取的RNA逆轉錄成cDNA并置于-20℃保存。通過(guò)SYBRGreen法進(jìn)行熒光定量，反應體系如下（20μL）：無(wú)RNA酶水7.4μL，SuperRealPreMixPlus（SYBRGreen）10μL，上下游引物各0.8μL，cDNA模板1μL。RT-PCR反應條件：94℃預變性3min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。計算方法采用比較CT值法。涉及的引物序列見(jiàn)表1。

(3）數據統計分析

采用SPSS20.0統計軟件，試驗數據以平均數±標準偏差（Mean±SD）表示，用單因素方差分析（one-wayANOVA）及多重比較（Duncan）進(jìn)行差異顯著(zhù)性分析，P＜0.05為差異顯著(zhù)。

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