2.2.4 加熱時(shí)間的影響

為探究加熱時(shí)間對顯色的影響，1 mL 64 mg·L^-1的 GABA水溶液、1 mL pH=7磷酸緩沖溶液和2 mL 1.8 g·L^-1的水合茚三酮醇溶液，混勻定容后，100℃下沸水浴不同時(shí)間，冷卻后用水定容至5 mL搖勻，測567 nm處的吸光度。由圖2 d可知：吸光度隨加熱時(shí)間延長(cháng)整體呈增加趨勢。加熱時(shí)間小于10 min時(shí)，吸光度很小，說(shuō)明顯色產(chǎn)物的量極少，反應很不完全；沸水浴10～40 min時(shí)，吸光度隨加熱時(shí)間迅速增加，超過(guò)40 min后增加的趨勢明顯減緩。這說(shuō)明水合茚三酮與GABA反應需要加熱時(shí)間足夠，顯色反應才能完全，本文確定60 min為最佳顯色加熱時(shí)間。

2.3 茚三酮顯色法測定GABA的性能評價(jià)

2.3.1 線(xiàn)性范圍和檢出限

以試劑空白為參比，對不同濃度的GABA在優(yōu)選條件下經(jīng)水合茚三酮顯色后測定，以吸光度對GABA的濃度作圖，得水合茚三酮顯色測定GABA的工作曲線(xiàn)。對結果進(jìn)行擬合，結果表明：在0.5～80 mg·L^-1的濃度范圍內，吸光度(y)與GABA濃度(x)符合方程 y=0.01234x-0.00113，R2=0.99983，線(xiàn)性較好。根據三倍標準偏差計算得到該方法測定GABA的檢出限為21.6 μg·L^-1，靈敏度較高。

2.3.2 重現性與抗干擾實(shí)驗

良好的重現性是進(jìn)行準確分析測定的前提。通過(guò)水合茚三酮顯色，對相同濃度的GABA溶液進(jìn)行7次平行顯色，每份重復測定3次。經(jīng)計算可知，平均吸光度的相對標準偏差為0.026%，說(shuō)明該方法精密度高，重現性好。

一定的選擇性是保證分析結果準確度的關(guān)鍵。為此，本文通過(guò)對比40 mg·L^-1 GABA在加入不同干擾物前后的吸光度值變化來(lái)研究該方法的抗干擾能力。干擾物的選擇主要是樣品中可能存在的共存組分和根據顯色原理可能會(huì )干擾的一些物質(zhì)。首先分別測定40 mg·L^-1 GABA水溶液和相同GABA濃度但添加有不同濃度干擾物的混合液顯色后的吸光度，然后以不加干擾時(shí)的吸光度值為分母，以添加干擾物后的吸光度為分子，計算所得比值可表示加入干擾后吸光度的相對變化。比值越接近1，說(shuō)明該物質(zhì)干擾越小。由圖3知，加入1.5 mg·L^-1淀粉(Starch)、15 mg·L^-1聚乙二醇8000(PEG 8000)、45 mg·L-1 Fe3+、30 mg·L-1 Fe2+、15 mg·L^-1氯化亞錫和15 mg·L^-1二氧化鈰時(shí)的比值都在0.97～1.02之間，說(shuō)明上述干擾物對茚三酮顯色法測定40 g·L^-1 GABA的干擾較小，相對誤差不超過(guò)3%，該方法具有一定的抗干擾能力。

2.4 樣品測定和結果確認

為避免樣品中可能存在的其他氨基酸或蛋白質(zhì)等對測定結果的影響，將含有GABA的食品添加劑配成100 mg·L^-1 的水溶液，再對其進(jìn)行薄層色譜分離，取相應斑點(diǎn)溶解后，在選定條件下測吸光度，計算出GABA的濃度為45.51 mg·L^-1，即GABA在樣品中含量為45.51%。

為檢驗樣品測定結果的準確性，進(jìn)行了三個(gè)不同濃度的加標回收實(shí)驗，結果如表1所示，加標回收率在95.4～117.6%范圍內，說(shuō)明準確度較好。

此外，為進(jìn)一步檢驗樣品測定結果的準確性，排除薄層色譜未將GABA與其他氨基酸分離的可能，將2.5 g·L^-1 GABA、0.25 g·L^-1 L-苯丙氨酸和0.25 g·L^-1L-組氨酸的混合液在相同色譜條件下分離，結果如圖4所示。1號位為L(cháng)-組氨酸，2號位為GABA，3號位為L(cháng)-苯丙氨酸，這說(shuō)明在此條件下GABA可被有效分離。

綜上可知，利用本文所建立的方法可較準確地測定GABA的含量。

3 結論

基于目前文獻報道的水合茚三酮顯色測定氨基酸的條件有明顯差異，考慮到氨基酸結構不同可能導致顯色條件和測定波長(cháng)不同，本文針對在食品和醫藥領(lǐng)域具有重要研究意義的GABA，研究了不同溶劑、顯色酸度、顯色劑用量、顯色溫度和時(shí)間等因素對水合茚三酮與GABA顯色反應的影響，發(fā)現在pH=7.0時(shí)，0.5 mg·L^-1～80 mg·L^-1濃度范圍內的GABA與1.8 g·L^-1水合茚三酮乙醇溶液沸水浴60 min， 反應生成的有色產(chǎn)物在567 nm處的吸光度與GABA濃度線(xiàn)性關(guān)系良好，確立了一種利用水合茚三酮定量測定GABA的簡(jiǎn)單方法。實(shí)驗證明，該方法有較好的重現性和一定的選擇性，結合薄層色譜對實(shí)際樣品進(jìn)行分析和結果驗證，準確度較高。本文所建立的方法不僅可直接用于一些樣品中GABA的定量檢測，也可作為液相色譜的檢測手段，這在當前GABA被日益廣泛關(guān)注和大量應用的情況下具有重要意義。

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