作為中國“四大名醋”之一的山西老陳醋，其采用傳統自然固體發(fā)酵并結合獨特熏、淋、曬等工藝，形成老陳醋獨特的酸、綿、香、甜風(fēng)味與口感。老陳醋的獨特風(fēng)味得益于微生物菌群的生長(cháng)和代謝以及復雜的協(xié)同作用，產(chǎn)生豐富的香味物質(zhì)，除霉菌、酵母菌、乳酸菌、醋酸菌外，芽孢菌也是山西老陳醋發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中的重要微生物種群，它在老陳醋風(fēng)味和功能成分的形成中起到重要作用。

芽孢桿菌是一類(lèi)數量眾多的細菌，需氧或兼性厭氧，桿狀，革蘭氏陽(yáng)性，能夠在某些條件下形成內生孢子。國內外關(guān)于芽孢桿菌的研究已有多年歷史，對于芽孢桿菌的形態(tài)觀(guān)察、分類(lèi)鑒定、生理機制、功能發(fā)掘以及生物防治等方面的研究已相當透徹。2016年，王進(jìn)龍從山西老陳醋中分離出的芽孢菌有：解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamy-loliquefaciens）、地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheni-formis）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、短小芽孢桿菌（Bacilluspumilus）、萎縮芽孢桿菌（Bacillusatrophaeus）、巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）。

芽孢菌在陳醋釀造中起著(zhù)重要的作用。乙偶姻是山西老陳醋重要功能成分川穹嗪的前體物質(zhì)，而芽孢菌產(chǎn)乙偶姻的能力比乳酸菌、醋酸菌更強、更穩定。國內外相關(guān)產(chǎn)乙偶姻菌種的篩選、育種、發(fā)酵工作也大都集中于芽孢菌。2015年，高文睿等從涼州熏醋中篩選出高產(chǎn)乙偶姻的芽孢菌Y4，產(chǎn)量為2.376mg/mL；2013年，張顯采用傳統誘變方法對枯草芽孢桿菌JNA3-10進(jìn)行復合誘變，獲得1株2，3-丁二醇脫氫酶（BDH）缺失型乙偶姻高產(chǎn)突變株JNA-UD-6，消耗150g/L葡萄糖，得到53.9g/L的乙偶姻和6.5g/L的2，3-丁二醇；2017年，Li等通過(guò)改變2，3-丁二醇的轉化策略，提高了地衣芽孢桿菌乙偶姻的產(chǎn)量。芽孢菌在陳醋中除對產(chǎn)乙偶姻有重要貢獻外，還產(chǎn)生多酚類(lèi)物質(zhì)，從而賦予山西老陳醋抗氧化的功能。2014年，郇阿梅等從四川傳統麩醋醋醅中篩選出1株芽孢菌YB-32，培養24h后產(chǎn)生的總酚含量為263.6μg/mL。另外，芽孢菌還可產(chǎn)不揮發(fā)性酸，緩解山西老陳醋中乙酸的強烈刺激性酸味，使醋的口感更柔和醇厚。芽孢菌的代謝產(chǎn)物與發(fā)酵體系中的其它物質(zhì)發(fā)生反應，生成一些風(fēng)味物質(zhì)，如乳酸乙酯、乙酸乙酯、檸檬酸乙酯、二羥基丙酮等，這些物質(zhì)可以很好地改善食醋風(fēng)味。在白酒產(chǎn)業(yè)中，關(guān)于產(chǎn)香芽孢菌的篩選和應用積累了大量的研究資料，而在陳醋研究中鮮有關(guān)于產(chǎn)香芽孢菌的篩選和應用方面的報道。

醋酸菌和乳酸菌是山西老陳醋醋酸發(fā)酵階段的優(yōu)勢細菌菌群。醋酸菌是陳醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中的主要菌種，可以通過(guò)乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶催化反應將醇代謝為酸。目前，陳醋釀造中常用的醋酸菌有奧爾蘭醋桿菌（Acetobacterorleanense）、許氏醋桿菌（Acetobacterschuegenbachii）、彎曲醋桿菌（Acetobactercurvum）、紋膜醋桿菌（Aceto-bacteraceti）、惡臭醋酸桿菌（Acetobacterran-cens）、攀膜醋桿菌（Acetobacterascendans）、膠膜醋桿菌（Acetobacterxylinum）等。醋酸菌在釀醋過(guò)程中除產(chǎn)酸外，還產(chǎn)乙偶姻（川穹嗪前體物質(zhì)）等功能性物質(zhì)。Dai等報道了1株漢氏醋桿菌（acetobacterhansenii）產(chǎn)乙偶姻量達8.93g/L。在醋酸發(fā)酵階段中除醋酸菌產(chǎn)酸外，乳酸菌也可產(chǎn)生乳酸等不揮發(fā)性酸，減緩由總酸含量引起的刺激味道，使酸味更柔和、醇厚。此外，乳酸菌產(chǎn)生的乳酸及其它不揮發(fā)性酸與醇類(lèi)物質(zhì)生成乳酸乙酯等各種酯類(lèi)物質(zhì)，也可豐富山西老陳醋的風(fēng)味和香氣。

微生物之間的互相作用可以增加其代謝物和功能物質(zhì)的含量。關(guān)于芽孢菌間的互作研究主要集中在白酒大曲的強化。2011年，楊濤等將5株嗜熱芽孢桿菌、3株酵母菌及1組復合產(chǎn)酸菌應用于醬香白酒生產(chǎn)中，使得香味基酒的比例增加，并且白酒中的己酸和己酸乙酯含量也顯著(zhù)提高；2017年，莊孝杰等從醬香型酒醅中篩選出具有優(yōu)良特性的拜耳接合酵母，研究其與地衣芽孢桿菌的互作，結果表明地衣芽孢桿菌促進(jìn)了拜耳接合酵母的乙醇轉化率，共培養體系中風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)和含量也受到很大影響。2015年，吉晉波對分離自鎮江香醋醋醅的8株乳酸菌及2株醋酸菌的相互作用進(jìn)行了研究，結果表明醋醅中醋酸菌與乳酸菌穩定共存，并對比分析了二者純培養及共培養發(fā)酵液中風(fēng)味化合物的差異。

本文從山西老陳醋釀造過(guò)程中分離的54株芽孢菌中，篩選出2株發(fā)酵性狀優(yōu)良的芽孢桿菌菌株，研究了這兩株芽孢菌之間，及與醋酸菌和乳酸菌間的相互作用，考察了其在純培養和不同比例共培養條件下對生物量、乙偶姻、多酚、總酯、不揮發(fā)性酸、有機酸和揮發(fā)性香氣成分的影響，為將來(lái)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)山西老陳醋釀造復配直投式發(fā)酵劑進(jìn)行了重要的基礎研究和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

醋醅取自醋廠(chǎng)醋酸發(fā)酵0，1，3，5，7，9，11d的醋醅。巴氏醋桿菌33、植物乳桿菌19為實(shí)驗室前期篩選的優(yōu)勢優(yōu)良菌株，保存至山西農業(yè)大學(xué)食品與工程學(xué)院生物工程實(shí)驗室。

1.1.2 培養基與試劑

MRS培養基，青島高科園海博生物科技有限公司；模擬醋醅培養基，山西老陳醋醋廠(chǎng)醋酸發(fā)酵第2天的醋醅，即為模擬醋醅培養基；醋酸菌培養基：酵母10g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL，pH7.0，121℃高壓蒸汽滅菌20min，滅菌后加4%無(wú)水乙醇。細菌DNA提取試劑盒，北京博邁德基因科技有限公司；PCR引物，由深圳華大基因公司合成；MakerD、MIX，上海生工生物工程有限公司；福林試劑、肌酸（均為分析純），北京索萊寶科技有限公司；草酸、丙酮酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸（均為色譜純），天津市光復精細化工研究所。

1.2 主要儀器、設備

T100型PCR儀、UniversialHoodⅡ型凝膠成像系統，美國B(niǎo)io-Rad公司；DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀，北京六一儀器廠(chǎng)；722型可見(jiàn)分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；戴安U3000液相色譜儀，賽默飛世爾科技有限公司；Trace1300氣相色譜儀，TraceISQ質(zhì)譜分析儀；5417R型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 山西老陳醋源芽孢菌的分離和鑒定

在無(wú)菌、常溫條件下，將25g樣品加入內置玻璃珠的225mL無(wú)菌生理鹽水中，140r/min振蕩培養20min，使其混勻；然后梯度稀釋?zhuān)x取10^-5，10^-6，10^-73個(gè)梯度，涂布于MRS瓊脂平板培養基中，37℃恒溫培養箱中培養1～2d。選取菌落數在30～300的平板，挑取其上表面粗糙、菌落形態(tài)較大的單個(gè)菌落涂片和革蘭氏染色，在電子顯微鏡（1000×）下觀(guān)察菌株細胞形態(tài)和拍照。對鏡檢結果為革蘭氏陽(yáng)性、有芽孢的桿狀菌株用試劑盒提取其基因組，16SrDNA測序比對，并用MEGA5.1軟件構建系統進(jìn)化樹(shù)。應用的引物如下：上游：5′-CA-GATGGGAGCTTGCTCCCTG-3′；下游：5′-CGACTTCACCCAATCATCTG-3′。將鑒定結果為芽孢菌的，反復劃線(xiàn)于MRS平板培養基，37℃培養，直至獲得純化的菌株，對其菌落拍照。

1.3.2 山西老陳醋源優(yōu)良芽孢菌的篩選

將54株已鑒定的芽孢菌接種于MRS液體培養基中，37℃恒溫培養24h后，取菌株發(fā)酵液3mL，參照文獻、測定總酯含量及不揮發(fā)性酸含量。將發(fā)酵液8000r/min離心10min，取上清液1mL，采用福林-酚比色法測定多酚含量。取上清液3mL，采用O'Meara-比色法測定乙偶姻含量。

1.3.3 解淀粉芽孢桿菌1539與枯草芽孢桿菌803的相互作用研究

將篩選出的優(yōu)良芽孢菌株解淀粉芽孢桿菌1539與枯草芽孢桿菌803分別接種于MRS液體培養基中，37℃培養24h，菌體濃度均達到1×10⁶CFU/mL時(shí)，分別按照解淀粉芽孢桿菌1539與枯草芽孢桿菌803接種比例為1:0，0:1，1:0.1，1:0.5，1:1，1:5，1:10（V/V），總接種量為2%，加入30g醋醅模擬培養基，37℃靜置培養6d。

1）生物量的測定

采用MRS培養基稀釋平板菌落法測定解淀粉芽孢桿菌1539與枯草芽孢桿菌803的生物量。

2）乙偶姻、多酚、總酯、不揮發(fā)性酸含量的測定

取10g上述培養6d的樣品，加入90mL蒸餾水浸泡30min，4000r/min離心10min，取上清液，采用上述1.3.2節方法，測定純培養和共培養體系中芽孢菌的乙偶姻、多酚、總酯、不揮發(fā)性酸含量。

3）有機酸含量的測定

取5g上述培養6d的樣品，用超純水定容50mL，12000r/min離心5min，取上清液，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，采用外標法測定草酸、酒石酸、丙酮酸、蘋(píng)果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸及琥珀酸等8種有機酸的含量，用He-mI和Simca軟件繪制有機酸的Heatmap圖和PCA圖。色譜測定條件為：液相系統UItimate3000；色譜柱C184.6mm×150mm，5μm；流動(dòng)相20mmol/LNaH2PO4，pH2.7；進(jìn)樣量20μL；流動(dòng)速度0.8mL/min；檢測器UV210nm；柱溫：室溫。

4）揮發(fā)性香氣種類(lèi)和含量的測定

采用頂空固相微萃取方法萃取上述培養6d的1g樣品，用直接內標法測定其揮發(fā)性香氣的種類(lèi)和含量，用HemI和Simca軟件繪制揮發(fā)性香氣的Heatmap圖和PCA圖。色譜條件：色譜柱為VF5MS（30mm×0.25×0.25mm），載氣為氦氣（純度99.999%），流量1mL/min，不分流。程序升溫：起始溫度40℃，保持3min，以4℃的速度升至160℃，保持1min，再以10℃/min的速度升至270℃保持5min。質(zhì)譜條件：接口溫度280℃，離子源溫度280℃，電子能量70eV，掃描質(zhì)量范圍41～500amu。

相關(guān)鏈接：丙酮酸，蘋(píng)果酸，乙偶姻，酒石酸

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