1.3.6 酶的定位及活性測定

1）粗酶液的制備

將屎腸球菌R2以3%接種量接種到黃漿水培養基中，于37℃下靜置培養，分別于12，24，36h取發(fā)酵液。發(fā)酵液于4℃下5000r/min離心10min，得菌液上清及沉淀；菌體沉淀用生理鹽水洗滌2次后，懸浮于2mL、pH=5.0乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，于冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎，超聲功率130W，破碎時(shí)間15min，間隔時(shí)間2s。破碎后于4℃、12000r/min下離心10min，得菌體碎片和破碎上清；菌體碎片用5mL、pH=5.0乙酸-乙酸鈉緩沖溶液洗滌2次后溶于1mLpH=5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液中用作酶活測定，菌液上清、破碎上清直接進(jìn)行酶活測定。

2）繪制標準曲線(xiàn)

準確稱(chēng)取0.1391g對硝基苯酚，精確到0.001g，用0.2mol/L碳酸鈉溶液定容至100mL，4℃下保存備用。依次移取對硝基苯酚標準貯備液1，2，3，4，5，7，9mL，用0.2mol/L碳酸鈉溶液定容至100mL，配成濃度為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.7，0.9mmol/L的對硝基苯酚標準工作液。

吸取1mL對硝基酚標準溶液于試管中，加入1mLpH=5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液；對照的空白試管中加入2mLpH=5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液；在所有的試管中加入8mL0.2mol/L碳酸鈉溶液，振蕩，在400nm處測定吸光值。以對硝基苯酚含量為X軸、吸光值為Y軸，繪制標準曲線(xiàn)。標準曲線(xiàn)方程為Y=1.642X+0.006，R²=0.999。

3）酶活測定

將粗酶液、10mmol/L對硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷溶液和10mmol/L對硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷溶液分別于37℃水浴中預熱10min。然后吸取0.4mL粗酶液于干凈的試管中，分別加入0.4mL對硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷溶液或10mmol/L對硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷溶液，破碎上清和破碎沉淀酶活測定以緩沖液代替粗酶液作為空白對照，菌液上清酶活測定以加熱使酶失活的上清液作為空白對照，于37℃中水浴10min后，加入3.2mL0.2mol/L碳酸鈉溶液，振蕩混勻，終止酶反應，待冷卻至室溫后，將反應液于400nm處測定吸光值。按照標準曲線(xiàn)回歸方程計算樣品中菌液上清、破碎上清和破碎沉淀中的α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活力。

酶活力單位定義：在37℃，pH5.0條件下，1min催化生成1nmol對硝基苯酚所需要的酶量為1個(gè)酶活單位（U）。

1.3.7 對DPPH·清除能力的測定

參考劉力的方法略有修改，取2.0mL0.05g/LDPPH無(wú)水乙醇溶液，加入2.0mL發(fā)酵液，搖勻，置于25℃水浴中避光反應30min后，于8000r/min下離心10min，期間注意避光。在517nm處測定吸光度值。蒸餾水作為對照，Ｔrolox作為標準物質(zhì)，繪制標準曲線(xiàn)。標準曲線(xiàn)方程Y=-0.0285X+0.8299，R²=0.9907，結果以μgＴrolox/mL表示。

1.4 數據處理

結果以平均值±標準差表示。使用SPSS18.0軟件對結果進(jìn)行統計分析（One-wayANOＶA），利用Duncan’smultiplerangetest方法進(jìn)行顯著(zhù)性分析，選取P＜0.05為顯著(zhù)水平。采用OriginPro8.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵過(guò)程中酸度的變化

豆腐黃漿水中含有小分子糖類(lèi)、蛋白質(zhì)及一些生物活性物質(zhì)，適于微生物的生長(cháng)，pH值可以反映屎腸球菌R2發(fā)酵黃漿水后形成的游離H+和有機酸的變化情況。圖1為屎腸球菌R2發(fā)酵黃漿水過(guò)程中OD值和pH的變化規律。從圖1中可以看出，屎腸球菌R2能夠利用豆腐黃漿水中的小分子糖類(lèi)生長(cháng)，降低黃漿水的pH值。隨著(zhù)發(fā)酵時(shí)間的延長(cháng)，菌體生長(cháng)量逐漸增加，pH值逐漸下降，其中12～24h之間菌體生長(cháng)最快，pH下降最明顯。

2.2 發(fā)酵處理對豆腐黃漿水中低聚糖含量的影響

2為屎腸球菌R2發(fā)酵豆腐黃漿水過(guò)程中低聚糖含量的變化規律。新鮮豆腐黃漿水中5種糖的含量為19418.22mg/L，其中水蘇糖和蔗糖含量較高，水蘇糖含量占5種糖含量的58%，蔗糖含量占5種糖含量的30%，棉籽糖、葡萄糖和果糖的含量相對較低。在屎腸球菌R2發(fā)酵豆腐黃漿水的過(guò)程中，低聚糖含量均有不同程度的下降。發(fā)酵12h后，葡萄糖的含量迅速下降，利用率達到43%，其次為棉籽糖和果糖，利用率均為17%，水蘇糖和蔗糖的利用率較低，分別為4%和3%；發(fā)酵24h后葡萄糖基本利用完畢，無(wú)法檢出。此時(shí)，果糖的利用率達到68%，棉籽糖的利用率達到22%，水蘇糖和蔗糖的利用率均為12%。表明屎腸球菌R2在發(fā)酵豆腐黃漿水時(shí)優(yōu)先利用葡萄糖，其次為果糖和棉籽糖；發(fā)酵36h后，果糖的含量幾乎沒(méi)有發(fā)生變化（P＜0.05），蔗糖的利用率達到31%，棉籽糖和水蘇糖的利用率分別為38%和24%。因此，經(jīng)過(guò)屎腸球菌R2的發(fā)酵作用，可以有效地緩解棉籽糖和水蘇糖引起的胃脹氣。

2.3 屎腸球菌R2α-半乳糖苷酶的定位及活性分析

棉籽糖和水蘇糖的代謝需要α-半乳糖苷酶，研究表明，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillusrhamnosus）、干酪乳桿菌（Lact.casei）、植物乳桿菌（Lactplantarum）、發(fā)酵乳桿菌（Lact.fermentum）、短乳桿菌（Lact.sbrevis）、布氏乳桿菌（Lact.buchneri）、腸膜明串株菌（Leuconostocmesenteroides）和羅伊氏乳桿菌（Lact.reuteri）等在發(fā)酵的過(guò)程中可以分泌α-半乳糖酶，將α-半乳糖苷類(lèi)寡糖水解為可消化的糖類(lèi)。屎腸球菌R2不同部位的α-半乳糖苷酶酶活見(jiàn)圖3。如圖3所示，菌液上清酶活幾乎為零，說(shuō)明α-半乳糖苷酶沒(méi)有被分泌到細胞外，屎腸球菌R2的α-半乳糖苷酶不是胞外酶；細胞破碎并離心后，細胞破碎上清和破碎沉淀均具有酶活，說(shuō)明屎腸球菌R2的α-半乳糖苷酶屬于胞內酶；細胞破碎沉淀酶活顯著(zhù)高于破碎上清酶活，說(shuō)明該酶以可溶性蛋白和不可溶性蛋白兩種形式存在，且主要以不可溶性蛋白形式為主。這一結果與Ames等的研究一致，其研究表明大多數α-半乳糖苷酶位于G+陽(yáng)性菌細胞質(zhì)中。Mital等研究證明乳酸菌所產(chǎn)生的α-半乳糖苷酶類(lèi)的活性范圍在pH4.5～8.0，而屎腸球菌R2發(fā)酵36h后pH下降到3.58（圖1），嚴重偏離了該酶的最適pH，這導致了豆腐黃漿水中棉籽糖和水蘇糖被部分分解（圖2），而不是被全部降解，這一結果與付亭亭等的研究一致。

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