如圖2所示，當牡蠣發(fā)酵培養基的接種量為4％時(shí)，氨基態(tài)氮的含量最高，但是蛋白質(zhì)含量未達到最低。接種量在繼續增加的同時(shí)，氨基態(tài)氮和蛋白質(zhì)二者的含量走向都呈現降低趨勢。這可能是因為在接種量過(guò)低時(shí)，納豆芽孢桿菌繁殖較慢，產(chǎn)酶過(guò)少；而當菌種接種量過(guò)大時(shí)，菌種繁殖過(guò)快，密度過(guò)大，導致氧氣接觸不足，導致代謝產(chǎn)物較少。而且牡蠣肉作為納豆芽孢桿菌繁殖代謝的主要營(yíng)養基質(zhì)，其中豐富的蛋白質(zhì)被納豆芽孢桿菌自身分泌的蛋白酶分解成寡肽和氨基酸，使得發(fā)酵液中含有豐富的氨基態(tài)氮。而當發(fā)酵液中小分子肽和氨基酸含量與蛋白質(zhì)含量相差較多時(shí)，納豆芽孢桿菌會(huì )優(yōu)先消耗小分子物質(zhì)，從而導致當接種量過(guò)多時(shí)蛋白質(zhì)與氨基態(tài)氮的含量均隨之逐漸降低。表明在接種量2％～6％之間時(shí)，氨基態(tài)氮處于含量最高期。

如圖3所示，當接種量固定為4％時(shí)，發(fā)酵時(shí)間在12h～48h范圍內，氨基態(tài)氮的含量在不斷增加，在發(fā)酵時(shí)間為48～60h時(shí)稍有下降，可能是由于納豆芽孢桿菌消耗蛋白質(zhì)的同時(shí)開(kāi)始利用小分子的氨基酸導致，也有可能是因為蛋白酶活力在發(fā)酵48h時(shí)達到最大，發(fā)酵時(shí)間是影響納豆芽孢桿菌產(chǎn)酶的重要因素，在產(chǎn)酶總量達到最大值之后繼續發(fā)酵可能會(huì )導致蛋白酶酶活下降。在12h～60h期間，蛋白質(zhì)的含量在不斷下降。在36h～48h期間氨基態(tài)氮含量與蛋白質(zhì)含量的變化趨緩，此時(shí)的納豆芽孢桿菌在水解蛋白質(zhì)和消耗氨基酸的過(guò)程中處于平衡期。納豆芽孢桿菌產(chǎn)酶最高值后應立即停止發(fā)酵，否則酶活力會(huì )出現回落現象。因此，在固定條件接種量為4％和發(fā)酵時(shí)間48h下進(jìn)行后續試驗。

2、正交試驗優(yōu)化發(fā)酵條件

在固定料液比l:4(g／mL)，發(fā)酵溫度37℃和葡萄糖添加量2％的基礎上，對單因素試驗的數據結果進(jìn)行分析并選取合適的發(fā)酵條件范圍，以發(fā)酵pH、接種量、發(fā)酵時(shí)間為主要因素，并以測定的氨基態(tài)氮含量作為參考，進(jìn)行三因素三水平L₉(3³)正交優(yōu)化試驗，具體試驗方案和結果見(jiàn)表1。

由表1分析可知，以氨基態(tài)氮含量為指標，各因素的影響依次為A＞B＞C，即接種量對氨基態(tài)氮含量的影響最大，其次是發(fā)酵時(shí)間，發(fā)酵pH對氨基態(tài)氮含量的影響最小。由正交試驗結果分析確定最佳優(yōu)化工藝條件：A₃B₃C₂，即發(fā)酵pH為7，接種量為6％，發(fā)酵時(shí)間為48h。

由表2方差分析可知，此次試驗的三個(gè)因素中，接種量對氨基態(tài)氮含量具有顯著(zhù)性影響(P＜0．05)，發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵pH對試驗結果無(wú)顯著(zhù)性影響(P＞0.05)。

3、驗證試驗

為驗證正交試驗所得結果的可靠性，在上述最佳發(fā)酵工藝條件下進(jìn)行三次平行試驗并測定發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量。經(jīng)測定，所得發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量為0．785mg／mL，與正交試驗結果接近，證實(shí)試驗結果可靠。

三、結論

本試驗以低價(jià)購買(mǎi)市場(chǎng)淘汰的牡蠣廢料作為發(fā)酵主要原料，用納豆芽孢桿菌對其進(jìn)行發(fā)酵，可以提高牡蠣的利用價(jià)值。固定料液比1:4，發(fā)酵溫度37℃和葡萄糖添加量2％，通過(guò)單因素試驗選取適宜發(fā)酵條件范圍：發(fā)酵pH為6～8，接種量為2％～6％，發(fā)酵時(shí)間為24h～48h。在此基礎上，通過(guò)正交設計優(yōu)化試驗確定納豆芽孢桿菌發(fā)酵牡蠣的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵pH7，接種量6％，發(fā)酵時(shí)間48h，此時(shí)發(fā)酵液中氨基態(tài)氮的含量達到0．791mg／mL。

本試驗的發(fā)酵結果表明，納豆芽孢桿菌可以用于牡蠣的發(fā)酵，為水產(chǎn)動(dòng)物的應用提供了理論基礎，為蛋白高值化提供了依據，同時(shí)為水產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供新的方向，充分利用市場(chǎng)淘汰的牡蠣邊角料。而且，發(fā)酵水解液氨基態(tài)氮含量豐富，水解液經(jīng)過(guò)濃縮提取也可以制備氨基酸口服液、氨基酸含片、氨基酸護膚品、氨基酸添加劑等，本研究為氨基酸產(chǎn)品的制備提供了依據。

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