近日，華南農業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗室、嶺南現代農業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗室劉耀光院士團隊在國際知名植物生物學(xué)學(xué)術(shù)期刊《Journal of Integrative Plant Biology》（IF2020=7.061，生物學(xué)一區）在線(xiàn)發(fā)表題為“The ScCas9++ variant expands the CRISPR toolbox for genome editing in plants”的研究論文（論文鏈接地址：https://www.jipb.net/EN/10.1111/jipb.13164）。該研究利用來(lái)源于狗鏈球菌的優(yōu)化的CRISPR/ScCas9++新變體，開(kāi)發(fā)了廣靶向的植物基因組編輯與胞嘧啶單堿基編輯器，為植物功能基因組學(xué)研究和作物遺傳改良提供了新的研究工具。

 

　　目前，CRISPR/Cas基因組編輯技術(shù)已成為功能基因組學(xué)研究和作物遺傳改良的重要工具。但其編輯范圍常受到PAM基序及其編輯窗口的限制。因此，開(kāi)發(fā)具有更廣泛PAM識別范圍的Cas變體是擴大CRISPR/Cas系統編輯使用范圍的一個(gè)重要研究方向。ScCas9是來(lái)源于狗鏈球菌（Streptococcus canis）的Cas9蛋白，與目前最常用的SpCas9蛋白（Streptococcus pyogenes,識別NGG-PAM）具有89.2%的高度相似性，識別靶向范圍更廣的NNG-PAM，但其在動(dòng)、植物中的編輯效率都較低，難以推廣使用。前人通過(guò)對ScCas9的PAM-DNA互作結構域和loop基序中的氨基酸進(jìn)行替換，獲得了進(jìn)化型的ScCas9+和ScCas9++變體，并在動(dòng)物細胞中表現出高的編輯活性和廣的編輯范圍。然而ScCas9+和ScCas9++變體在植物中的編輯能力如何仍然不清楚。

 

　　為了擴展植物CRISPR/Cas系統的靶向范圍，劉耀光院士團隊根據水稻密碼子偏好性?xún)?yōu)化了ScCas9及其兩個(gè)進(jìn)化的ScCas9+和ScCas9++變體的編碼DNA序列，系統地研究了它們對22個(gè)靶位點(diǎn)的編輯效率。結果發(fā)現ScCas9++的編輯效率比ScCas9和ScCas9+效率更高，但是它主要識別NGG-PAM靶點(diǎn)，而其它NNG靶點(diǎn)識別能力很低。該團隊利用編輯效率最高的缺刻酶變體ScCas9n++構建了一個(gè)具有evoBE4max結構的新的胞苷堿基編輯器（CBE）PevoCDA1-ScCas9n++，在NNG-PAM上實(shí)現了穩定高效C?T的多重堿基編輯，并具有更寬的編輯窗口（C-1–C17），且沒(méi)有靶點(diǎn)序列的偏好。進(jìn)一步利用PevoCDA1-ScCas9n++對OsWx（3靶點(diǎn)）和OsEui1（2靶點(diǎn)）同時(shí)進(jìn)行多靶點(diǎn)編輯，高效地產(chǎn)生了直鏈淀粉含量降低的新的優(yōu)異水稻種質(zhì)。

 

　　該研究為ScCas9++變體在植物基因組編輯中的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與應用打下了基礎、提供了思路。其缺刻酶變體ScCas9n++在堿基編輯器開(kāi)發(fā)中具有更大的應用潛力。此CBE編輯器PevoCDA1-ScCas9n++為多靶點(diǎn)的單堿基編輯提供更為有效的工具，有望在基因功能篩選、大規模飽和突變、編輯調控元件、引入提前終止密碼子或進(jìn)行可變剪接等研究中有廣泛應用。

 

　　生命科學(xué)學(xué)院碩士研究生劉濤利和博士后曾棟昌為論文的共同第一作者，劉耀光院士和祝欽瀧教授為論文的共同通訊作者。該研究獲得廣東省基礎與應用基礎研究重大項目、國家自然科學(xué)基金項目和廣東特支計劃科技創(chuàng )新青年拔尖人才專(zhuān)項的資助。（文/生命科學(xué)學(xué)院）