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枯草芽孢桿菌中胞壁肽的分離純化及其對芽孢的影響(一)

來(lái)源:鄭州天順食品添加劑有限公司 發(fā)布時(shí)間:2021-09-19 12:47:07 關(guān)注: 0 次
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芽胞是病菌在自然環(huán)境威逼(如超低溫、旱災和營(yíng)養成分欠缺等)下產(chǎn)生的休眠狀態(tài)體。因其特有的構造特點(diǎn)而對高溫、髙壓、干躁、輻射源、超低溫、腐蝕成分等具備較強的抵抗性。如何把芽胞消滅一直是食品殺菌行業(yè)亟需攻克的至關(guān)重要的問(wèn)題。目前消滅芽胞主要是靠傳統式的高溫、髙壓的方式 ,殊不知高溫、髙壓在消滅芽胞的與此同時(shí),也會(huì )造成營(yíng)養食品外流,口味、口味等質(zhì)量的明顯降低。怎樣在常溫狀態(tài)消滅芽胞一直是食品類(lèi)行業(yè)科研工作人員的一大挑戰。研究發(fā)現,當芽胞出芽后,其抵抗性消退,這也為消滅芽胞給予了一個(gè)合理對策?,F如今,先出芽后消滅是消滅芽胞的一個(gè)最重要途徑。

肽聚糖是細菌細胞壁的主要成分,由N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)和N-乙酰胞壁酸(MurNac)根據β-1,4糖苷鍵聯(lián)接匯聚而成。與MurNac相接的先后是L-Ala,γ-Glu,m-Dpm和D-Ala。革蘭氏陽(yáng)性菌陰性菌和陽(yáng)性菌的關(guān)鍵差異在第三個(gè)碳水化合物,大部分陽(yáng)性菌的第三個(gè)碳水化合物是L-Lys。胞壁肽是肽聚糖酶解后物質(zhì)。研究表明,帶有Dpm的胞壁肽是一種合理的出芽劑,能推動(dòng)芽胞出芽。最少的合理結構單元的胞壁肽為二糖三肽,其二聚體或三聚體仍然能誘發(fā)芽胞出芽。目前,中國都還沒(méi)有關(guān)胞壁肽分離純化的報導,都沒(méi)有有關(guān)胞壁肽對芽胞出芽的危害科學(xué)研究。文中根據酶解等方式取得成功分離純化了胞壁肽,科學(xué)研究胞壁肽針對芽胞出芽的危害,為后期科學(xué)研究打下基礎。

1原材料與方式

1.1實(shí)驗原材料

枯草枯草芽孢菌(Bacillus.subtilis168),購自我國的工業(yè)技術(shù)微生物菌種菌種保藏管理處(CICC)。

1.2實(shí)驗實(shí)驗試劑

LB液體培養基,北京索萊寶高新科技有限責任公司;BacterialAgar(BD);α-胃蛋白酶、蛋白酶、變溶菌素,選購自英國Sigma企業(yè);其他實(shí)驗試劑均為分析純。

1.3儀器設備及機器設備

顛倒光學(xué)顯微鏡,德國蔡司企業(yè);高效率液相色譜儀,日本安捷倫儀器企業(yè);超高效液相色譜-質(zhì)譜分析液質(zhì)儀,英國沃特世企業(yè);電加熱恒溫培養箱,上海一恒高新科技有限責任公司;傅里葉變換紅外光譜分析掃描機,英國珀金埃爾默企業(yè);500兆磁共振譜儀,法國布魯克企業(yè);工作壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫療器械廠(chǎng);多用途酶標儀,法國帝肯企業(yè);勻質(zhì)粉碎儀,英國Fastprep24;冷凍離心機,日本日立企業(yè)。

1.4實(shí)驗方式

1.4.1枯草枯草芽孢菌芽胞的制取

菌苗首先用LB瓊脂粉培養液活性3代之上,連接2×SG培養液中涂板塑造。在37℃塑造2d后,用相差顯微鏡鏡檢查芽胞,當視線(xiàn)中絕大多數芽胞從纖維細胞中掉下來(lái)后,用冷的無(wú)菌檢測雙蒸水將培養液上的芽胞清理搜集到離心管架中,離心式標準為8000g、4℃、10min,離心式多次。離心式歷程中確保全過(guò)程在低溫標準中開(kāi)展。離心式后去除上清液,得到的芽胞沉積重懸在A(yíng)CES緩沖溶液(0.05mol/L,pH7.0)中,最終用相差顯微鏡鏡檢查,視線(xiàn)中≥95%的芽胞展現光亮狀即可應用。芽胞濃度值約為1.0×108CFU/mL,儲放于4℃電冰箱,一個(gè)月內應用。

1.4.2芽胞平板電腦記數

將芽胞混液開(kāi)展梯度方向稀釋液,枯草枯草芽孢菌芽胞選用營(yíng)養成分瓊脂粉培養液開(kāi)展竭盡平板電腦記數,每一個(gè)平板電腦中添加1mL稀釋液菌液??莶菘莶菅挎呔堪?7℃標準下開(kāi)展塑造,塑造24h。除菌實(shí)際效果用芽胞降低的多數表明:lg(Nt/N0),在其中,Nt為解決后生存的菌體數,N0為解決前菌落總數。

1.4.3芽胞出芽實(shí)驗

汲取適當芽胞液于離心管架中,添加適量出芽劑。置放在搖床中塑造1h(37℃,200r/min)。以后將芽胞液放進(jìn)80℃水浴中加溫20min。平板電腦記數測算芽胞出芽率。

1.4.4肽聚糖的獲取

選用枯草枯草芽孢菌(Bacillussubtilis168)的植物細胞獲取肽聚糖。選購的菌苗在液體培養基中活性3代后應用。將枯草枯草芽孢菌注射到LB瓊脂粉培養液上,于37℃塑造24h。取新鮮單菌體注射到適當的LB液體培養基中塑造至OD600約1.0,離心式搜集菌體(8000×g、4℃、10min),用冷的無(wú)菌檢測雙蒸水清理2次。將沉積再次飄浮于8%SDS水溶液中,燒開(kāi)30min,離心式(13000×g,15min,25℃)搜集沉積,清理多次直到去除殘存的SDS。SDS解決去除了菌體的其他蛋白,非共價(jià)鍵融合的蛋白和脂多糖。將沉積溶解無(wú)菌檢測雙蒸水中勻質(zhì)粉碎儀粉碎病菌,不可溶植物細胞成分再根據離心式搜集(40000×g,30min,25℃)。搜集的不可溶植物細胞進(jìn)一步用α-胃蛋白酶、蛋白酶開(kāi)展酶解,以去除植物細胞上的糖元、共價(jià)鍵融合的蛋白。之上二步酶解均在緩沖溶液中開(kāi)展(10mmol/LTris-HCl,pH8.0),在蛋白酶中必須添加10mmol/LCaCl2。將酶解液添加SDS(終質(zhì)量濃度1%)燒開(kāi)鈍化處理蛋白酶,并清理去除SDS。將植物細胞再次飄浮于鹽酸(5mg細胞壁飄浮于2mL48%HF)中,4℃解決48h。HF能夠去除肽聚糖上磷酸二酯鍵共價(jià)鍵聯(lián)接的次生植物細胞含糖量,包含磷壁酸、poly-(β,1-6GlcNAc)等。植物細胞成分再各自選用8mol/LLiCl和0.1mol/LEDTA清理,無(wú)菌水清理2次,最終選用甲苯去除脂磷壁酸和脂多糖。將試品干凍,獲得肽聚糖。

1.4.5胞壁肽分離純化

將獲取的肽聚糖飄浮于12.5mmol/L聚磷酸鹽緩沖溶液(1mmol/LMgCl2,pH6.0,0.02%疊氮化鈉)中,添加5μg/mL變溶菌素,于37℃酶解24h。酶解的胞壁肽必須選用硼氫化鈉復原,避免Cl的異構化。將胞壁肽飄浮于100mL0.5mol/L的硼酸鹽緩沖溶液(pH9.0)中。胞壁肽復原選用新鮮配置的25mL,25mg/mLNaBH4,在添加全過(guò)程使得pH維持在9.0。氧化反應在室內溫度中維持15min并不斷地震蕩,添加H3PO4使反映停止,將pH調為4。所得的試品儲存在-20℃。復原的胞壁肽選用HPLC(Shimadzu)分離出來(lái),ODS色譜柱(Hypersiloctadecylsilanecolumn,250mm×4.6mm,顆粒物:5μm,30105-254630,ThermoFisherScientific)。過(guò)柱液分別是:A,40mmol/L倍他米松(pH4.5);B,40mmol/L倍他米松(pH4.0)并添加20%(摩爾分數)工業(yè)甲醇。A、B流動(dòng)性看中添加0.00025%的疊氮化鈉。離子交換柱均衡柱頭選用流動(dòng)性相A,柱溫52℃,流動(dòng)速度0.5mL/min,均衡1h??扇馨陔臍庀?00μL,氣相5min后,過(guò)柱程序流程為B流動(dòng)性相以線(xiàn)形梯度方向從0到100%,時(shí)間為5min到270min,流動(dòng)性相流動(dòng)速度維持在0.5mL/min。胞壁肽成分檢驗選用紫外線(xiàn)探測器,光波長(cháng)為206nm

1.4.6胞壁肽成分除鹽

胞壁肽成分干凍后再次飄浮于無(wú)菌檢測超純水系統中,選用HPLC法開(kāi)展除鹽,離子交換柱為上述情況分離出來(lái)柱。柱頭選用0.007%(摩爾分數)三氟乙酸均衡,柱溫35℃,流動(dòng)速度1mL/min,胞壁肽選用50%工業(yè)甲醇(0.0025%三氟乙酸)線(xiàn)形梯度方向(0~100%)過(guò)柱,過(guò)柱時(shí)間在30~50min中間,胞壁肽成分檢驗選用紫外線(xiàn)探測器,光波長(cháng)為206nm。

1.4.7三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜評定

除鹽的胞壁肽成分選用三重四級桿串連質(zhì)譜儀器(QuattroMicro,Micromass)開(kāi)展評定。全逐行掃描(MSScan)質(zhì)譜分析標準:共價(jià)鍵(ESI )數據收集方式造成準分子離子峰[M H] ;m/z掃描儀范疇100~2000u;毛細血管工作電壓3.5kV;錐孔工作電壓40V;提純工作電壓5.0V;離子源溫度110℃;脫有機溶劑溫度450℃;脫有機溶劑氣650L/h;錐孔反吹氣檢查50L/h;RF鏡片工作電壓0.5V。

1.4.8紅外掃描光譜儀

選用壓片糖果法將1.5mg干凍的GM-TriDAP與200mg干躁的KBr在瑪瑙研缽中混和碾磨勻稱(chēng),放置模具中,用粉末壓片機完成壓片糖果(工作壓力為20~30MPa)1min,取出后獲得全透明的試品片狀,用傅里葉變換紅外線(xiàn)譜儀開(kāi)展紅外光譜分析的掃描儀,掃描儀范疇4000~500cm-1。

1.4.91HNMR

將2mg干凍的GM-TriDAP試品溶解1mLD2O中,低溫干燥并反復3次將糖肽中的開(kāi)朗H換置,溶解0.5mLD2O之后放置核磁管中,磁共振剖析選用500兆磁共振譜儀,室內溫度20℃,500MHz作氫譜。

1.5數據分析與剖析

全部實(shí)驗均反復3次。制圖應用Origin8.5手機軟件。

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