羥基甲酸乙酯（Ethylcarbamate，EC）是一種在小動(dòng)物甚至人體內具備潛在性致癌物質(zhì)的2A類(lèi)致癌物質(zhì)，存有于多種多樣發(fā)酵食品及酒精飲料中，如生抽、乳酪、紅酒、米酒等。研究表明，尿素溶液、瓜氨酸、氨甲酰硫酸銨、氰酸和焦炭酸二甲酸是EC產(chǎn)生的磷酸激酶物，在其中酵母和一部分乳酸菌飲料根據精氨酸新陳代謝路徑造成的尿素溶液和瓜氨酸是最重要的2種磷酸激酶物。

酒水的瓜氨酸關(guān)鍵自精氨酸脫亞胺酶方式新陳代謝造成，在這里一方式中包含3種重要酶，各自為精氨酸脫亞胺酶（Argininedeimidase，ADＩ，EC3.5.3.6）、鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D移酶（Ornithinetranscarbamoylase，OTC，EC2.1.3.3）和羥基苯甲酸蛋白激酶（Carbamatekinase，CK，EC2.7.2.2）。該方式將精氨酸水解反應，最后轉換為鳥(niǎo)氨酸、氨和二氧化碳。

現階段有關(guān)鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉移酶的分析較少，關(guān)鍵聚集在人體內，因為是肝部尿素循環(huán)的必不可少酶，因而OTC酶的缺少常造成總想睡覺(jué)、惡心嘔吐、精神實(shí)質(zhì)生長(cháng)遲緩等病癥，與此同時(shí)OTC的缺少是否也可做為肝細胞癌的初期檢測指標值之一。依據以前的研究發(fā)現，OTC與羥基甲酸乙酯的產(chǎn)生呈負關(guān)聯(lián)性，即OTC的表述對EC的產(chǎn)生有抑制效果，殊不知OTC與EC的立即關(guān)聯(lián)性末見(jiàn)科學(xué)研究報導。

短乳酸桿菌是一類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧菌，在含蛋白質(zhì)的小動(dòng)物、綠色植物發(fā)醇商品及其溫血爬行動(dòng)物的消化道中十分普遍，做為一般覺(jué)得安全性（Generallyrecognizedassafe，GRAS）的食品級不銹鋼微生物菌種，在食品類(lèi)、工業(yè)生產(chǎn)、農業(yè)及制藥等行業(yè)中亦有著(zhù)關(guān)鍵的使用使用價(jià)值。發(fā)掘益天性乳酸菌飲料源的抗氧化物是現在我們的側重點(diǎn)之一。

本分析以短乳酸桿菌中的鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D移酶為目標，根據分子克隆表述方式和Ni-NTA提純方式，得到很多純度高的OTC酶，在米酒發(fā)醇的不一樣環(huán)節可以直接加入到酒質(zhì)中，科學(xué)研究其與EC中間的相互影響，為發(fā)掘其潛在性的工業(yè)生產(chǎn)使用使用價(jià)值打下基礎。

1 原材料與方式

1.1 原材料與實(shí)驗試劑

短乳酸桿菌（Lactobacillusbrevis）和質(zhì)粒pET28a由本試驗室儲存，大腸埃希菌（Escherichiacoli）BL21（DE3），全試金企業(yè)。病菌基因獲取檢測試劑盒、質(zhì)粒DNA獲取檢測試劑盒、PCR物質(zhì)回收利用檢測試劑盒、瓊脂糖電泳回收利用檢測試劑盒、Ni-NTA瓊脂糖環(huán)氧樹(shù)脂、L-精氨酸、L-瓜氨酸、DL-鳥(niǎo)氨酸、茚三酮、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（ＩPTG）、鹽酸卡那霉素（Kan），生工生物工程項目（上海市）股權有限責任公司；T4DNA連接酶、約束性?xún)惹忻窧amHＩ、SalＩ，TaKaRa企業(yè)；麥曲、酒藥，浙江省塔牌黃酒企業(yè)。

1.2 方式

1.2.1 鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D移酶的復制

短乳酸桿菌OTC酶的正方向引物設計編碼序列為：5’-cgcggatccATGACTAAGGATTTTCGGGAAAATGTA-3’（下橫線(xiàn)為BamHＩ鑒別編碼序列），反方向引物設計編碼序列為：5’-acgcgtcgacTTAAGCTCGTGGAATGAATAAGTTACCT-3’（下橫線(xiàn)為SalＩ鑒別編碼序列）。以短乳酸桿菌的基因DNA為模版開(kāi)展基因擴增，PCR物質(zhì)經(jīng)1%瓊脂糖電泳電泳原理認證后開(kāi)展提純。

1.2.2 資產(chǎn)重組表述質(zhì)粒的搭建

選用約束性?xún)惹忻窧amHＩ和SalＩ各自對短乳酸桿菌OTC基因片段和媒介pET-28a開(kāi)展雙酶切。酶切物質(zhì)經(jīng)檢測試劑盒回收利用后，聯(lián)接并轉換大腸埃希菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，施膠在含卡那霉素的LB平板電腦上，經(jīng)菌體PCR認證后，挑選獲得呈陽(yáng)性復制，并轉錄組測序評定目地基因序列。

1.2.3 資產(chǎn)重組鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D移酶的誘發(fā)表述與分離純化

挑菌呈陽(yáng)性單菌體注射于5mL含卡那霉素的LB培養基中，于37℃，200r/min震蕩塑造留宿。按1%（摩爾分數）接種量接轉于200mL的LB培養基中，再次于37℃，200r/min震蕩塑造，至OD600nm做到0.6～0.8時(shí)，添加異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（ＩPTG），于25℃，180r/min誘發(fā)塑造留宿。離心式搜集菌體后，添加30mL緩沖溶液（50mmol/LNaH2PO4，300mmol/LNaCl，20mmol/LＩmidazole，pH8.0）重懸菌體，接著(zhù)冰水浴超聲波粉碎體細胞，于4℃，12000r/min離心式20min，得到上清液。參考Ni-NTA瓊脂糖環(huán)氧樹(shù)脂的應用說(shuō)明方法，選用親和層析提純重組蛋白，接著(zhù)運用SDSPAGE檢驗蛋白質(zhì)純凈度及分子質(zhì)量。

1.2.4 米酒釀制全過(guò)程及實(shí)驗解決方式

以0.8kg檽米為原材料，30℃下浸米2d，高溫蒸制后制冷，添加160g麥曲和1.6g酒藥及0.96L水，攪拌均勻后于28℃發(fā)醇。以未作任意解決的當然發(fā)醇米酒做為對照實(shí)驗（CK），在發(fā)醇第5天添加提純后的鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D移酶（5D），在發(fā)醇第12天添加同樣濃度值的鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D移酶（12D），剖析較為發(fā)醇全過(guò)程中EC以及有關(guān)類(lèi)化合物的差別。

1.2.5 羥基甲酸乙酯的HPLC-FLD測量

測定法參考Fu等[3]的報導，試品與0.1mL，1.5mol/L硫酸和0.2mL，0.01mol/L占噸醇正丙醇水溶液衍化后，根據高效液相色譜色譜分析檢驗。以工業(yè)甲醇和水做為流動(dòng)性相，瑩光探測器激起光波長(cháng)233nm，發(fā)送光波長(cháng)600nm，梯度方向過(guò)柱氣相。

1.2.6 尿素溶液、瓜氨酸和鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D移酶活的測量

尿素溶液和瓜氨酸的檢查方式各自參考陳宜宜等和Boyde等的參考文獻上述，根據與鉻黑T的顯色反應來(lái)檢驗發(fā)酵物中的成分。
取發(fā)酵物超聲波15min粉碎體細胞，于4℃，12000r/min離心式20min，取上清為原蛋白質(zhì)提取液。依據茚三酮顯色反應來(lái)測量OTC酶活，蛋白質(zhì)成分則選用Bradford法完成測量。本實(shí)驗中OTC酶活界定為每分水解反應1mg蛋白造成1μmol鳥(niǎo)氨酸所須要的酶量為一個(gè)酶活企業(yè)。

1.2.7 米酒基本物理化學(xué)質(zhì)量的檢測分析

1.2.7.1 米酒中分散碳水化合物的含水量測量

選用日本日立L-8900碳水化合物檢測儀開(kāi)展測量。檢驗基本原理為選用茚三酮做為衍化劑與碳水化合物衍化后檢測分析。前解決辦法為：取50mL米酒試品，加0.1mol/L鹽酸溶液超聲波震蕩5min，加5%磺酸水楊酸鈉除去蛋白質(zhì)，離心式后選用氮吹儀濃縮，加0.02mol/L硫酸2mL，震蕩后過(guò)膜，上機操作檢驗。

1.2.7.2 揮發(fā)物口味成分的檢驗

將8mL酒樣和0.2gNaCl添加頂空罐中，50℃下磁力攪拌加溫15min后，將提純頭插進(jìn)頂空罐中，再次于50℃下加溫30min后入樣。GC色譜儀標準：載氣為N2，流動(dòng)速度為1mL/min，無(wú)分離氣相；程序升溫：原始柱溫40℃，維持5min，以5℃/mL的速度加熱至230℃，維持10min。氣相口溫度250℃，GC分析時(shí)間2.5min。質(zhì)譜分析標準：電子器件負電子離子源（EＩ）電子能量為70eV，離子源溫度250℃，插口溫度250℃，檢驗口工作電壓為350V。掃描儀方法為全掃描儀，質(zhì)量范圍為35～350。

1.2.7.3 電子器件舌味蕾剖析

相對性于感觀(guān)鑒評方式，電子器件舌完成了酸、苦、澀、咸、鮮和清甜味等基本上味及回味無(wú)窮的智能化點(diǎn)評，具備結果平穩且受影響小的優(yōu)勢。

加入適量被測試品放置電子器件舌檢測杯里，對其酸、甜、苦、澀、咸、鮮等基本上味及回味無(wú)窮開(kāi)展測量，不一樣味蕾與感應器一一對應，全部感應器各自在對照品水溶液和米酒試品中泡浸、清洗，測得電勢差值Vr和Vs，根據對Vs-Vr值的測算，就可以對米酒的酸、甜、苦、澀、咸和鮮香等基本上味和回味無(wú)窮開(kāi)展剖析。每一個(gè)試品反復測試4～5次，為降低系統偏差，選后3次列入數據統計分析。

1.2.8 數據信息數據分析

每一個(gè)實(shí)驗反復3次，選用SPSS手機軟件對標值開(kāi)展差別顯著(zhù)性分析。