1前言

綠色植物細菌病蟲(chóng)害是導致農業(yè)產(chǎn)品耗損的首要緣由之一，在現實(shí)制造中產(chǎn)生了無(wú)法估量的財產(chǎn)損失。病菌浸染主莖后，使糧食作物部分或整棵感病，危害植物生長(cháng)發(fā)育，比較嚴重時(shí)導致主莖身亡，造成農業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)量減少，質(zhì)量降低。大部分病菌不但能在植物生長(cháng)發(fā)育歷程中危害主莖情況，仍在農業(yè)產(chǎn)品的輸送全過(guò)程中導致商品易腐爛，是導致蔬菜水果運送耗損的首要緣故。除此之外，一部分細菌病菌可以代謝真菌毒素，服用帶有真菌毒素的蔬菜水果可以造成畸胎或引起癌病，威協(xié)人們身心健康。如多種多樣鏈格孢造成的鏈格孢內毒素及其多種多樣曲霉造成的伏馬菌素B。

幾丁質(zhì)，是由N-酰胺基-D-葡萄糖胺（N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）單個(gè)根據β-1，4-糖苷鍵聯(lián)接的高聚物，也是病源真菌細胞壁的主要成分。在絲狀真菌中，幾丁質(zhì)和別的聚糖成分占細胞壁成分的70%之上，在一部分酵母菌中，幾丁質(zhì)成分乃至做到細胞干重的10%～20%。幾丁質(zhì)酶能夠根據外切和/或內切圓核糖核苷酸功效將幾丁質(zhì)裂化為GlcNAc或GlcNAc的可溶寡聚體。因而，以幾丁質(zhì)做為分子結構靶點(diǎn)，根據幾丁質(zhì)酶的水解作用來(lái)完成植物病害預防是植物病害操縱的重要途徑。而害蟲(chóng)防治因素代謝植物細胞裂化酶，裂化病源真菌細胞壁，也變成害蟲(chóng)防治微生物菌種拮抗作用綠色植物病源細菌的具體體制之一。

排風(fēng)管菌（Bjerkanderaadusta）歸屬于非褶菌目，多孔結構菌科，排風(fēng)管菌屬?，F階段，針對排風(fēng)管菌（Bjerkanderaadusta）的分析主要是聚集在環(huán)境生態(tài)工程行業(yè)，但仍不缺排風(fēng)管菌對綠色植物細菌病蟲(chóng)害整治的分析報導。1982年，Dománski發(fā)覺(jué)排風(fēng)管菌可以抑止櫟樹(shù)（Quercusrobur）褐腐病的產(chǎn)生。2011年，Bak等研究發(fā)現了排風(fēng)管菌對歐美國家黑楊（Populuseuramericana）干腐病具備防治工作能力；2015年，汪華等挑選出一株對水稻紋枯病菌或瓜亡革菌（Thanatephoruscucumeris）、大麗輪枝菌（Verticilliumdahliae）、茄科羅爾氏菌（Ralstoniasolanacearum）等造成的植物病害具備非常好防效的排風(fēng)管菌M-1；2017年，Zhang等研究發(fā)現排風(fēng)管菌可以合理的抑止西瓜蔓枯病原菌（Didymellabryoniae），并在2018年初次研究了排風(fēng)管菌對核盤(pán)菌的抑制效果以及對油菜菌核?。⊿clerotiniasclerotiorum）的防效。但現階段，依然欠缺排風(fēng)管菌害蟲(chóng)防治體制科學(xué)研究。本科學(xué)研究融合抗病性實(shí)際效果和RT-qPCR剖析，初次從排風(fēng)管菌中挑選并復制出一個(gè)幾丁質(zhì)酶遺傳基因，并根據外源性表述證實(shí)了該酶的抗真菌藥活力。推斷該遺傳基因是排風(fēng)管菌充分發(fā)揮生防功效歷程中的植物細胞裂化酶遺傳基因。

2原材料與方式

2.1原材料

本氏煙（Nicotianabenthamiana）。

排風(fēng)管菌（Bjerkanderaadusta）菌種BK-1從四川省馬爾康市土壤層中得到，儲藏于本試驗室，ITS系列號為MW182414（NCBI）。鏈格孢（Alternariaalternata）菌種CD-1，鏈格孢iPhone專(zhuān)化型（Alternariaalternataf.sp.mali）L-1，細極鏈格孢（Alternariatenuissima）SCAU-1和灰紅提孢（Botrytiscinerea）DY-1均為本試驗室儲藏菌苗。尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）（BNCCNO.143078），茄鏈格孢（Alternariasolani）（BNCCNO.337910）購自北納生物（BeNaCultureCollection，BNCC）。

PCR引物設計見(jiàn)表1及表2。

2.2方式

2.2.1排風(fēng)管菌抗病性工作能力剖析

將灰紅提孢，鏈格孢和細極鏈格孢接轉到PDA培養液中25℃活性塑造7d，應用外徑為5mm的打孔器割除真菌瓊脂塊做為接種物；排風(fēng)管菌活性塑造7d后，將5個(gè)直經(jīng)為5mm的排風(fēng)管菌真菌瓊脂塊注射至液態(tài)的100mLPDB培養液中25℃，180r/min活性塑造7d后應用破碎機粉碎，做成排風(fēng)管菌真菌懸浮液做為抗菌液（AntiL）預留。

石蠟切片試驗：從生長(cháng)發(fā)育30d的香煙主莖上裁取身心健康的香煙葉子水流清洗10min，應用保鮮袋封死葉莖創(chuàng )口處，置放于無(wú)菌水淋濕的三層過(guò)濾紙上，在主葉柄兩邊對稱(chēng)性部位各自擦抹50μL無(wú)菌水和排風(fēng)管菌真菌懸浮液后注射病菌真菌瓊脂塊做為對照實(shí)驗和對照組，每一組6反復。再將葉子和過(guò)濾紙放進(jìn)頂層張口的塑料盒子中，頂層應用保鮮袋密封維持盒里潮濕。將其放置溫室大棚內（23℃，16h陽(yáng)光照射；18℃，8h黑喑），維持48h（細極鏈格孢浸染96h）后對香煙葉子開(kāi)展拍攝紀錄。

活體實(shí)驗：選擇身心健康的香煙主莖，將從上至下第4片葉子做為注射目標，接種方法同離體試驗。將注射后的主莖置放在密閉式，透光性且潮濕的育苗盆內，溫室大棚塑造48h（細極鏈格孢浸染96h）后照相紀錄。

以上試驗最少反復2次，并應用ImageJ開(kāi)展葉子感病總面積統計分析。

2.2.2生物信息學(xué)剖析

參照該菌種基因有關(guān)信息（NCBIBioProjectID：PRJNA667319），應用SignalPv5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對其幾丁質(zhì)酶遺傳基因和β-1，3-甘酶遺傳基因開(kāi)展信號肽預測分析；并在NCBI數據庫查詢(xún)（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對幾丁質(zhì)酶的傳統結構域開(kāi)展核對。

2.2.3僵持塑造及RT-qPCR剖析

將6種病源細菌和排風(fēng)管菌注射到PDA培養液中，25℃遮光情況下活性塑造5d，應用打孔器取各菌體邊沿處直徑為5mm的菌塊。各自將排風(fēng)管菌和一種病菌注射到新的PDA培養液中，各間距平板電腦邊沿2cm，并使兩菌塊維持在同一直徑網(wǎng)上25℃遮光塑造。

應用細菌RNA迅速抽提檢測試劑盒（生工），獲取僵持塑造研究中注射后第六d互相觸碰地區真菌的RNA，應用EasyScript©One-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix（全式金）開(kāi)展反轉錄獲得cDNA.以cDNA為模版，以18SrRNA做為參照遺傳基因，應用2×T5FastqPCRMix（SYBRGreenII）檢測試劑盒（擎科）對預測分析具備信號肽構造的幾丁質(zhì)酶遺傳基因和β-1，3-甘酶遺傳基因開(kāi)展表述量測量。

2.2.4排風(fēng)管菌幾丁質(zhì)酶遺傳基因BaCHIB復制

應用高保真音響酶1-5TM2×Hight-FidelityMasterMix（MCLAB）增加除去信號肽區間的幾丁質(zhì)酶遺傳基因BaCHIB-T，并在C端加上6×His蛋白純化標識。以排風(fēng)管菌cDNA為原始模版，事后PCR全過(guò)程先后應用上一步增加物質(zhì)為模版，獲得目地精彩片段BaCHIB-T，實(shí)際引物設計如下所示：①.BaCHIB-Cl-F/R；②.BaCHIB-Cl-F和His1-R；③.BaCHIB-Cl-F和His2-R；④.EcoRⅠ-T-F和NotⅠ-R。

應用約束性?xún)惹忻窫coRⅠ和NotI解決媒介pPIC9K.運用同源重組檢測試劑盒（諾唯贊）將BaCHIB-T與歸一化處理的媒介同源重組獲得資產(chǎn)重組媒介pPIC9K-BaCHIB-T（圖1），轉錄組測序恰當的表達載體應用約束性?xún)惹忻竤alⅠ歸一化處理，冰醋酸鋰轉化法轉換畢赤酵母（Pichiapastoris）GS115菌種。

2.2.5重組蛋白的體現和提純及抗真菌藥活力

蛋白質(zhì)的體現和提純依照Deng等的辦法開(kāi)展，并做好改善。資產(chǎn)重組媒介的表述菌種經(jīng)0.5%的工業(yè)甲醇誘發(fā)5d，同樣解決的滿(mǎn)載轉換菌種用以對照實(shí)驗。先后應用帶有80，100，120，140mmol/L咪唑的聚磷酸鹽緩沖溶液（PBS）過(guò)柱與柱融合的總體目標蛋白質(zhì)。目地雜帶經(jīng)SDS-PAGE電泳原理檢驗。幾丁質(zhì)酶活力測量應用幾丁質(zhì)酶活力診斷試劑盒（索萊寶）。

提純后的重組蛋白，濃度值調節為200μg/mL開(kāi)展抗真菌藥活力檢驗。從活性5d的鏈格孢，茄鏈格孢和灰紅提孢的平板電腦邊沿割除二塊周長(cháng)約為5～10mm的方形真菌瓊脂塊，并將其放置2mL離心管架中。每管添加400μL提純蛋白質(zhì)水溶液做為對照組，相等蛋白質(zhì)過(guò)柱液做為對照實(shí)驗25℃暗塑造48h后，觀(guān)查真菌生長(cháng)發(fā)育情況。