6、AFB₁最佳溶解標準的明確

由表4得知，二次線(xiàn)性回歸方程的實(shí)體模型極明顯，且方程式的回歸系數R²為0.8992，因而方程式的擬合程度高，可以恰當體現AFB₁溶解率與孵育時(shí)間、孵育溫度和酶魅力中間的關(guān)聯(lián)，根據DesignExpertv8.0.6手機軟件剖析AFB₁較大溶解率相匹配的反映情況為孵育時(shí)間15.030h、孵育溫度33.985℃、酶魅力2.107U，估計值為91.866%，考慮到操作過(guò)程，相匹配的孵育時(shí)間15h、孵育溫度34℃、酶魅力2U，獲得的AFB₁溶解率是91.08%，說(shuō)明AFB₁溶解率與估計值基本上符合，表明該實(shí)體模型能夠預測分析AFB₁較大溶解率。

7、AFB₁溶解物質(zhì)的總離子流色譜儀

如圖所示7所顯示，AFB₁經(jīng)漆酶溶解后檢驗到4個(gè)新的色譜儀峰，由峰形和分離度可看得出，各物質(zhì)分離出來(lái)實(shí)際效果不錯，且由保存期不一樣推斷溶解物質(zhì)不一樣。依據AFB₁和溶解物質(zhì)的保存期分辨5種化學(xué)物質(zhì)的正負極尺寸為A＞B＞C＞AFB₁＞D。

8、AFB₁溶解物質(zhì)的化學(xué)式及結構特征

為進(jìn)一步明確4種溶解物質(zhì)的化學(xué)結構式，運用Q-TOF-MS開(kāi)展剖析。在所有反映系統中，AFB₁只含C、H、O3元素表，酶的本質(zhì)為蛋白，運用酶溶解則很有可能引進(jìn)N原素。運用收集到的各溶解物質(zhì)的質(zhì)譜分析數據信息，預測分析各物質(zhì)很有可能的元素組成和化學(xué)式，如表5所顯示。

AFB₁關(guān)鍵由4個(gè)不一樣的溶解功效結構域:1）香豆素內酯環(huán)不穩定，在外部標準下能脫羰基）能與核苷酸、蛋白等融合的咪唑環(huán)烴基和H₂O、H等產(chǎn)生加成反應。3）環(huán)戊烯酮環(huán)根據加成反應、取代反應危害AFB1的毒副作用。4）苯環(huán)上的-0CH₃能夠與-OH、H、-CHO產(chǎn)生取代反應。與此同時(shí)，AFB₁的一部分溶解物質(zhì)中間還可以互相轉換。如圖所示8A所顯示，溶解物質(zhì)A在撞擊中造成[M H] 為m/z279.0932的磷酸激酶正離子，依據高分辨質(zhì)譜結果線(xiàn)性擬合的化學(xué)結構式為C₁₆H₂₂O₄，與此同時(shí)造成[M H] 為m/z201.0465、149.0236、121.0311的特點(diǎn)殘片正離子。依據二級質(zhì)譜分析特點(diǎn)正離子m/z149，并運用Scifinder和Reaxy數據庫查詢(xún)查找。由溶解物質(zhì)A的特點(diǎn)殘片正離子[M H] 為m/z149.0236推斷的結構特征與Samuel等分析出的Pseudomonasputida溶解AFB₁獲得的AFD3物質(zhì)構造一致，而且經(jīng)試驗認證該化學(xué)物質(zhì)對Hela體細胞的毒副作用遠低于A(yíng)FB₁。如圖所示8B所顯示，溶解物質(zhì)B在撞擊中造成[M H] 為m/z245.1282的磷酸激酶正離子，依據高分辨質(zhì)譜結果線(xiàn)性擬合的化學(xué)結構式為C₁₄H₁₆N₂O₂，與此同時(shí)造成[M H] 為m/z217.1332、120.0811、154.0735、70.0680的特點(diǎn)殘片正離子。依據二級質(zhì)譜分析特點(diǎn)正離子m/z271，推斷該化學(xué)物質(zhì)構造中存有一個(gè)羰基，并運用Scifinder和Reaxy數據庫查詢(xún)查找。如圖所示8C所顯示，溶解物質(zhì)A在撞擊中造成[M H] 為m/z197.1145的磷酸激酶正離子，依據高分辨質(zhì)譜結果線(xiàn)性擬合的化學(xué)結構式為C₇H₁₂N₆O₁與此同時(shí)造成[M H] 為m/z70.0678的特點(diǎn)殘片正離子。依據二級質(zhì)譜分析特點(diǎn)正離子，推斷該化學(xué)物質(zhì)中有吡咯烷構造，并運用Scifinder和Reaxy數據庫查詢(xún)查找。如圖所示8D所顯示，溶解物質(zhì)C在撞擊中造成[M H] 為m/z415.2427的磷酸激酶正離子，依據高分辨質(zhì)譜結果線(xiàn)性擬合的化學(xué)結構式為C₂₄H₃₀O₆，與此同時(shí)造成[M H] 為m/z397.1455、109.0863的特點(diǎn)殘片正離子。依據二級質(zhì)譜分析特點(diǎn)正離子m/z397和m/z109，推斷該化學(xué)物質(zhì)構造中存有一個(gè)甲基和苯甲醇結構單元，并運用Scifinder和Reaxy數據庫查詢(xún)查找。AFB₁經(jīng)漆酶溶解后的各物質(zhì)構造見(jiàn)圖9。

有研究表明持續損害-CO是AFB₁的具體的破裂方式，苯環(huán)上的叔丁基也會(huì )產(chǎn)生二甲苯和工業(yè)甲醇遺失。依據溶解方法的不一樣，AFB₁可產(chǎn)生甲基化、環(huán)空氣氧化、復原和脫氫等反映。AFB₁的生物溶解關(guān)鍵涉及到內毒素咪唑環(huán)或香豆素內酯環(huán)構造的裝飾，這2種構造是AFB₁具備高致癌物質(zhì)和高毒素的首要緣故。WangJianqiao等初次報導錳乳酸脫氫酶能夠根據將AFB₁轉換為AFB₁-8，9-二氫二醇而合理除去AFB₁的誘變活力。LiJianlong等運用抗鹽CandidaversatilisCGMCC3790溶解AFB₁獲得4種溶解物質(zhì)，推斷AFB₁有2種溶解方式，一種是內酯環(huán)和苯環(huán)被水解反應，另一種是利用加氫裂化毀壞內酯環(huán)的酯鍵和醛基。Samuel等19發(fā)覺(jué)AFB₁的咪唑環(huán)、內酯羰基和環(huán)戊烯酮環(huán)被Pseudomonasputida裝飾、毀壞而轉換成不一樣構造的化學(xué)物質(zhì)。

Afsharmanesh等22發(fā)覺(jué)F₄₂₀H₂還原酶能夠催化反應α-和β-不飽和脂肪酯一部分的烴基復原，BacC空氣氧化還原酶能夠催化反應香豆素內酯環(huán)烴基水解反應造成羧基，接著(zhù)產(chǎn)生脫羧基反映轉化成物質(zhì)。

酶溶解管理體系繁雜，漆酶在所有系統中起到催化反應，裂化成包括-NH2、R-NH2等官能團異構的小分子多肽、碳水化合物等化學(xué)物質(zhì)，能夠與AFB₁的活力結構域產(chǎn)生加持、替代等一系列反映，因而AFB₁的溶解途徑比較繁雜。本試驗獲得的4種溶解物質(zhì)均沒(méi)有咪唑環(huán)烴基、香豆素內酯環(huán)和環(huán)戊酮烯環(huán)，且含有烴基總數均低于A(yíng)FB₁很有可能在A(yíng)FB₁分子結構的以上毒副作用位置根據加持、替代或氧化還原反應造成了新的碳鍵。溶解物質(zhì)A（C₁₆H₂₂O₄）比AFB₁少一個(gè)-CO₂，多10個(gè)H，推斷有可能為AFB₁遺失-CO后產(chǎn)生脫羰基反映，構造中的烴基與H分子產(chǎn)生加持。溶解物質(zhì)B（C₇H₁₂N₆O）和C（C₁₄H₁₆N₂O₂）均帶有N原素，可能是管理體系中的含N小分子水化學(xué)物質(zhì)參加反映，且發(fā)覺(jué)相仿的裂化殘片，推斷有可能為AFB1產(chǎn)生持續的-CO遺失后，與H₂O和-NH₂產(chǎn)生加持和取代反應，轉化成物質(zhì)C和D。推斷溶解物質(zhì)D（C₂₄H₃₀O₆）的轉化成方式為咪唑環(huán)烴基產(chǎn)生加成反應而破裂，持續遺失-CO，烴基與H₂O和H產(chǎn)生加成反應。

AFs的毒素和致癌物質(zhì)體制早已被普遍科學(xué)研究，關(guān)鍵與二氫咪唑環(huán)和香豆素構造相關(guān)，根據對本科學(xué)研究溶解物質(zhì)構造的剖析，發(fā)覺(jué)咪唑環(huán)烴基和香豆素內酯環(huán)均被毀壞，因而推斷漆酶溶解AFB₁獲得的物質(zhì)毒副作用明顯小于親本內毒素。也是有研究表明AFB₁經(jīng)漆酶解決后，咪唑環(huán)烴基或內酯環(huán)裂化，物質(zhì)的瑩光性和誘變性變弱，且未監測到與AFB₁相仿的構造類(lèi)似物?？墒且驗槠崦傅膩?lái)源、溶解標準存有差異，也有可能導致減價(jià)物質(zhì)的毒副作用存有差別，必須 開(kāi)展身體之外細胞毒性、基因遺傳毒副作用試驗及其身體臨床實(shí)驗進(jìn)一步認證，評定溶解物質(zhì)的安全系數。

本分析挑選與栓菌漆酶lac3遺傳基因開(kāi)放閱讀框最大的3KW7做為模版開(kāi)展同宗模建，將AFB₁對收到漆酶的活性位置，數據顯示漆酶與AFB₁能夠相互影響，共價(jià)鍵是重要相互作用力，說(shuō)明漆酶可用以AFs的溶解。根據具體的溶解試驗認證，響應面提升得到AFB₁溶解率最佳的情況為應時(shí)間15h，孵育溫度34℃，酶魅力2U，溶解率可以達到91.08%。在這里前提下運用UPLC-Q-TOF-MS剖析AFB₁溶解物質(zhì)構造，發(fā)現4個(gè)關(guān)鍵溶解物質(zhì)，依據其二級質(zhì)譜分析信息內容和精準分子質(zhì)量，推斷出溶解物質(zhì)的化學(xué)式各自為C₁₆H₂₂O₄、C₁₄H₁₆N₂O₂、C₇H₁₂N₆O和C₂₄H₃₀O₆。

本試驗只對于最佳溶解情況下物質(zhì)的轉化成方式及構造開(kāi)展分析，針對不一樣溶解情況下物質(zhì)的差異未開(kāi)展討論，蛋白質(zhì)酶的來(lái)源及功效時(shí)間、溫度和酶魅力等外部要素也許會(huì )危害溶解方式及物質(zhì)構造，需進(jìn)一步開(kāi)展深入分析科學(xué)研究。海外對黃曲霉微生物樹(shù)脂吸附的分析較多聚集在乳酸菌飲料、芽孢桿菌和一些細菌中如樹(shù)形結構指孢霉（Dactyliumdendroide）、內寄生曲霉（Aspergillusparasiticus）、糙皮耳尖（Pleurotusostreatus）、莖點(diǎn)霉（Phomasp）、白腐菌掉色栓菌（Trametesversicolor）等。對乳酸菌飲料的科學(xué)研究大部分覺(jué)得乳酸菌飲料溶解AFB₁是根據微生物吸咐功效，Eshelli等科學(xué)研究了芽孢桿菌對AFB₁溶解推論其溶解方式很有可能和油酸及糖酵解途徑正中間產(chǎn)品的積累相關(guān)，而對細菌的研究表明其對AFB₁的溶解大部分為降解，關(guān)鍵利用微生物菌種代謝胰蛋白酶的酶促反應；如左文凱、楊文華等各自從細菌假蜜環(huán)菌（Armillariellatabescens）、黏病菌（Myxococcusfulvus）、施氏假單胞菌（Pseudomonasstutzeri）F4中獲得了能溶解AFs的胰蛋白酶，前二者還試著(zhù)了其在大腸埃希菌和畢赤酵母中實(shí)現表述，并開(kāi)展一些酶學(xué)基本上特性的剖析?？傮w來(lái)說(shuō)，現階段早已發(fā)覺(jué)能使AFs成分減少包含病菌、細菌和酵母以?xún)鹊拇蟾庞猩锨О俜N微生物菌種，可是大部分的分析關(guān)鍵注重在A(yíng)Fs溶解菌種的挑選和粗提液溶解功能的剖析上，針對不一樣微生物菌種來(lái)源于的胰蛋白酶的特性、構造和底物功效方式、溶解原理、物質(zhì)構造及溶解物質(zhì)毒副作用的認知仍欠缺進(jìn)一步的探討與討論。這很有可能與微生物菌種產(chǎn)酶量低，分離純化艱難，酶特性不穩定及功效標準嚴苛等因素相關(guān)。但伴隨著(zhù)細胞生物學(xué)、生物學(xué)、基因工程技術(shù)及酶工程等技術(shù)應用的發(fā)展完善，大家對酶的了解愈來(lái)愈清楚，資產(chǎn)重組載體構建、異源表述、電子自旋共震、同宗模建、分子模擬、分子結構分析等方法的創(chuàng )建使以上研究過(guò)程中的短板很有可能得到提升，有越多的方式和方式分析難題后面的實(shí)質(zhì)。