麥子皮膚過(guò)敏、乳糜瀉、非乳糜瀉麥子比較敏感(NCGS)等“麥子有關(guān)病癥”在世界各國的患病率在持續升高。針對這種病癥病人來(lái)講。防止攝取麥子致敏物蛋白質(zhì)是唯一且合理的方式圈。除研究皮膚過(guò)敏體制、找尋醫治的切入點(diǎn)外，產(chǎn)品研發(fā)低致敏性的麥子食材變成當下急需解決的難題。乳酸菌飲料在進(jìn)行發(fā)酵全過(guò)程中根據自己的蛋白質(zhì)水解系統軟件溶解有關(guān)蛋白及活性多肽，并根據產(chǎn)酸更改發(fā)酵面團的pH值以激話(huà)小麥面粉的內源胰蛋白酶.進(jìn)一步加強蛋白的溶解。在蛋白溶解為活性多肽及碳水化合物時(shí)，既更改了面糊口味，也更改了致敏蛋白質(zhì)的成分。除此之外，乳酸菌飲料新陳代謝造成的抗真菌藥化學(xué)物質(zhì)能夠增加商品貨架期，造成的胞外含糖量能夠改進(jìn)面包的質(zhì)量。鑒于此，乳酸菌發(fā)酵做為一種很有發(fā)展前景的發(fā)醇方法，非常值得進(jìn)一步的研究。乳酸菌飲料類(lèi)型多種多樣，現階段針對其減少麥子蛋白質(zhì)抗原性的分析多聚集于乳酸菌發(fā)醇層面。干酪乳桿菌被證明具備體細胞被膜胰蛋白酶，而這些酶在溶解蛋白的環(huán)節中起著(zhù)很重要的功效。除此之外，很多研究表明生產(chǎn)加工方法危害食材蛋白質(zhì)的抗原性，現階段用以減少食材蛋白質(zhì)抗原性的生產(chǎn)辦法具體有熱處理(蒸制、烤制等)和非熱處理(發(fā)醇、酶解、超聲波等)。蒸制等熱處理方法會(huì )變化食材蛋白質(zhì)的構像構造，進(jìn)而更改抗原體的構像表位。而抗原體蛋白質(zhì)線(xiàn)性表位的影響關(guān)鍵產(chǎn)生在發(fā)醇和酶解全過(guò)程中。Rao等研究發(fā)現超低溫烤制和清煮可以造成較低致敏性的花生仁。Rui等運用乳酸菌發(fā)醇減少了黃豆分離蛋白的抗原性。運用堿性蛋白酶和蛋白酶k持續酶解減少了麥子中致敏谷蛋白成分。本科學(xué)研究運用分離出來(lái)自發(fā)面中的1株干酪乳桿菌發(fā)酵面團，科學(xué)研究其對麥子致敏物蛋白質(zhì)成分及抗原性的危害，科學(xué)研究生產(chǎn)加工標準與抗原性中間的關(guān)聯(lián)，為開(kāi)發(fā)設計低致敏性麥子產(chǎn)品給予理論來(lái)源。

1 原材料與方式

1.1 原材料與實(shí)驗試劑

革蘭氏染色檢測試劑盒、病菌組DNA獲取檢測試劑盒、乳桿菌可選擇性瓊脂粉、Bradfbrd蛋白質(zhì)濃度值測定試劑盒、SDS-PAGE分離出來(lái)/濃縮膠緩沖溶液、預染蛋白質(zhì)Maker、SDS-PAGE蛋白質(zhì)上樣緩沖溶液、AP-羊抗兔二抗、BCIP/NBT偏堿磷酸酯酶著(zhù)色檢測試劑盒。北京索萊寶高新科技有限責任公司：EL-TMB著(zhù)色檢測試劑盒，上海市生工生物：實(shí)驗常用實(shí)驗試劑均為分析純級，兔皮膚過(guò)敏血清蛋白由試驗室自做。

1.2 關(guān)鍵儀器設備

PCR熱力循環(huán)儀，杭州市晶格常數儀器設備有限責任公司；凝膠成像系統軟件，上海市勤翔儀器設備有限責任公司；Mul-tiskanFC酶標儀，上海市賽默飛世爾企業(yè)；mini-proteanⅡ疑膠儀，英國伯樂(lè )相馬企業(yè)。

1.3 實(shí)驗方式

1.3.1 干酪乳桿菌的分離出來(lái)評定

稱(chēng)量酸面糊試品5g于無(wú)菌檢測勻質(zhì)袋里，添加45mL殺菌后的蛋白胨水(1％蛋白胨，0.43％NaCl，0.72％Na₂HP0₄，0.36％KH₂PH0₄，pH7.0)，攪拌后梯度方向稀釋液，取10^-5～10^-7稀釋液梯度方向，施膠于乳桿菌可選擇性瓊脂粉培養液，37℃塑造24h。任意挑菌菌體開(kāi)展過(guò)氧化氫酶和革蘭氏染色實(shí)驗。取雙氧水酶呈陰性、革蘭氏陽(yáng)性且鏡檢查為桿狀的菌種開(kāi)展進(jìn)一步分子結構評定。

選用病菌組DNA獲取檢測試劑盒獲取所分離出來(lái)菌種的DNA，運用病菌通用引物27F(5’-AGCG-GATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTrGTACGA-3’)和1492R(5’-GCAGAGTTCTCGGAGT.CACGAAGAGTlTI’GATCCTGGCTCAG-3’)根據PCR反映對16SrRNA遺傳基因開(kāi)展增加。PCR反映情況為：94℃預轉性5min：94℃轉性30s。55℃淬火30s，72℃拓寬5min，3五個(gè)循環(huán)系統：72℃充足拓寬10min。增加物質(zhì)經(jīng)瓊脂糖電泳電泳原理檢驗后送于北京市生工生物工程項目有限責任公司轉錄組測序。所得的編碼序列與NCBI百度文庫核對后，用MegaX搭建進(jìn)化樹(shù)。

1.3.2 菌種生長(cháng)曲線(xiàn)和菌體數與0D值對應關(guān)系的測量

取一支凍存菌苗于MRS液體培養基中，37℃下活性24h。取O.5mL活性菌液于6個(gè)各自配有30mLMRS骨頭湯的三角瓶中。37℃塑造0，4，8，12，16，20h，在光波長(cháng)600nm處精確測量各時(shí)間段菌液OD值值，制作生長(cháng)曲線(xiàn)。

取活性菌液用MRS骨頭湯稀釋液2，2.5，3，4，5，6倍，測量0D600nm值，并梯度方向稀釋液，竭盡于MRS瓊脂粉中，37℃塑造48h后測算活菌數。

1.3.3 酸面糊的制取

取指數值成長(cháng)期菌液，6000×g離心式10min，鹽水清洗2次，雙蒸水重飄浮至50mL，調整OD‰數值0.8。100g小麥面粉與50mL菌懸浮液資金投入壓面機。揉面15min，面糊內菌體總數約為108CFU/g。發(fā)酵溫度30℃，空氣濕度80％。發(fā)醇24h，按時(shí)抽樣。

1.3.4 發(fā)醇全過(guò)程中pH值、可滴定管酸值(TTA)和面團蛋白質(zhì)成分的測

每過(guò)2h抽樣，于無(wú)菌檢測勻質(zhì)袋里10倍稀釋液后混和勻稱(chēng)，測量pH值并且用0.1mol/LNa0H滴定管至pH數值8.3，紀錄所耗費Na0H的容積數即，TTA值。

將發(fā)酵面團試品干凍后研磨成粉于-20℃儲存。蛋白質(zhì)獲取參考Prado等的方式 。具體步驟如下所示：向500mg小麥面粉中添加10mL％s-HCl緩沖溶液(50mm01，L，pH8.8)，于4℃下拌和1h，20000×g，4℃離心式20min，搜集上清液(清蛋白和血蛋白)；沉積用5mL緩沖溶液清洗3次，添加10mL75％酒精，室內溫度下拌和1h，離心式20min，搜集上清液(醇溶蛋白質(zhì))；選用5mL75％酒精洗滌沉淀3次，添加10mL50mmol/LTris-HCl(pH8.8，1％SDS，0.5％DTT)，4℃拌和2h，離心式20min，搜集上清液(谷蛋白)。選用考馬斯亮藍法測蛋白濃度值。

1.3.5 SDS-PAGE電泳原理及免疫印跡剖析

參考Rao等的方式 ，具體步驟如下所示：制取12％的分離出來(lái)膠和5％的濃縮膠，試品溶液稀釋為同樣濃度值后與5x上樣緩沖溶液混和并開(kāi)水加溫5min，氣相后開(kāi)展豎直電泳原理(濃縮膠工作電壓80V，分離出來(lái)膠工作電壓110V)，電泳原理完畢后選用考馬斯亮藍R250上色，褪色后于凝膠成像系統軟件照相。

未上色的電泳原理膠遷移至硝酸纖維素膜上(300mA冰浴下轉膜90min)，麗春紅上色確定轉膜取得成功。添加5％脫脂奶，搖床邊搖晃封閉式2h；添加稀釋液的-抗(抗麥子蛋白質(zhì)兔血清蛋白)，4℃下孵育留宿；TBST緩沖溶液(0.02mol/LTBS，0.05％Tween-20，pH7.6)洗膜后，添加稀釋液的AP-羊抗兔二抗，室內溫度下孵育90min；洗膜后。運用BCIP/NBT偏堿磷酸酯酶著(zhù)色檢測試劑盒著(zhù)色。

1.3.6 不一樣發(fā)醇方法及熱處理方式制作饅頭

向100g小麥面粉(乳酸菌飲料菌體數108～109CFU/g)中添加50mL菌懸浮液和0.35g安琪酵母調配面糊后各自發(fā)醇。冷藏發(fā)酵標準為：4℃發(fā)醇3d后于37℃，80％空氣濕度發(fā)醇60min：一次發(fā)醇標準為：37℃，80％空氣濕度發(fā)醇60min；二次發(fā)酵標準為：中種面糊(60g小麥面粉，0.35g酵母菌，30mL菌懸浮液)于37℃發(fā)醇4h后添加40g小麥面粉和20mL水再次發(fā)醇1h。發(fā)醇好的3種面糊用以烘烤(180℃，20min)和煮制(開(kāi)水煮制20min)。抽樣干凍，研磨成粉預留。

1.3.7 蛋白質(zhì)成分及酶聯(lián)免疫吸咐實(shí)驗測

總蛋白獲取參考Akagawa等的方式 ，具體步驟如下所示：25mg小麥面粉添加1mL蛋白質(zhì)萃取液[40mmol/LTris，8mol/L尿素溶液，4％3-[3-(膽氟苯丙基)二甲羥基]丙磺酸內鹽(cHAPs)，冰浴下超聲波獲取30s，6次；4℃下16000×g離心式20min，搜集上清液，考馬斯亮藍法測蛋白量濃度。

選用酶聯(lián)免疫吸咐實(shí)驗點(diǎn)評試品抗原性。應用50mmol/L，pH9.6的硫化物緩沖溶液稀釋液蛋白質(zhì)至5μg/mL，按100μL孔添加酶標板，4℃靜放留宿；用TBST洗板4次，按150μL/孔添加1％BSA封閉液，37℃溫育2h；TBST洗板后按100μL/孔添加應用1％BSA稀釋液的抗麥子蛋白質(zhì)兔血清蛋白封閉液(1:10000)，37℃溫育2h，洗板；按100μL/孔添加500倍稀釋液的羊抗兔HRP-IgG，37℃溫育1h，洗板；應用TMB著(zhù)色檢測試劑盒著(zhù)色，于光波長(cháng)450nm處測0D值。

1.4 數據統計分析

實(shí)驗數據信息用SPSS手機軟件解決，圖由GraphPadPrism制作。