曲霉型水豆豉的制造能夠溯源至戰國時(shí)期，在我國具有悠久的歷史。傳統式曲霉型水豆豉選用當然注射酒曲制作，曲醅加上輔材后熟而成，具備營(yíng)養豐富、口味與眾不同的特征及養生作用。米曲霉做為曲霉型水豆豉發(fā)醇的優(yōu)越性微生物菌種，其酶系豐富多彩，可在水豆豉酒曲制作環(huán)節累積多種多樣抗氧化物，在其中的胰蛋白酶系（酸堿性、中性化、偏堿）至關(guān)重要，對水豆豉的質(zhì)量具有關(guān)鍵性功效。而在水豆豉酒曲制作全過(guò)程中，米曲霉關(guān)鍵產(chǎn)中性蛋白酶，其活力的多少影響了水豆豉發(fā)醇完善的期限和品質(zhì)，此酶可將大豆蛋白粉溶解為活性多肽、分散碳水化合物等，對水豆豉的營(yíng)養成分及口味產(chǎn)生具有很大功效。

在工業(yè)生產(chǎn)的情況下，選用非純種發(fā)醇對在我國水豆豉企業(yè)標準化生產(chǎn)制造具備關(guān)鍵實(shí)際意義。而良好的菌苗除開(kāi)產(chǎn)胰蛋白酶等酶系工作能力強，還應當具有生長(cháng)發(fā)育速度快、產(chǎn)胞子工作能力強等特性，產(chǎn)胞子工作能力強的菌苗更易于變成發(fā)醇全過(guò)程中的優(yōu)點(diǎn)菌苗，抑止其他菌苗的成長(cháng)和繁育，降低霉菌環(huán)境污染，減少發(fā)醇周期時(shí)間，提升生產(chǎn)率。但純天然菌種產(chǎn)酶工作能力較弱，無(wú)法融入工業(yè)生產(chǎn)，因而科研工作者實(shí)現了大批量的菌苗改進(jìn)工作中。夏楊復興根據對米曲霉中性蛋白酶I遺傳基因開(kāi)展定點(diǎn)突變，對搭建好的畢赤酵母Gsll5基因工程技術(shù)菌開(kāi)展工業(yè)甲醇誘發(fā)，發(fā)覺(jué)提升糖基化結構域后的基因突變酶魅力較野生型提升了11.5％

殊不知基因工程技術(shù)菌種在具體的制造運用遭受較大的限定，現階段在米曲霉的繁育層面依舊選用的是傳統的物理學(xué)化學(xué)誘變，而清華產(chǎn)品研發(fā)的自然壓室內溫度等離子技術(shù)誘變技術(shù)性做為一種新式的誘變技術(shù)性，對比于傳統式的誘變方式，其具備遺傳基因損害抗壓強度高、基因突變覆蓋面廣、安全性方便的優(yōu)點(diǎn)，明顯提高了菌種的突變率，近些年廣泛運用于微生物菌種繁育行業(yè)。該工藝的誘變基本原理根據大氣壓力頻射電弧放電形成的等離子技術(shù)（ARTP），等離子技術(shù)形成的很多活力顆粒與微生物菌種體細胞及周邊栽培基質(zhì)功效，造成很多的臭氧、活力氮氧自由基，并更改細胞質(zhì)的滲透性，這種活力顆粒和空氣氧化氧自由基進(jìn)到體細胞，與DNA、蛋白等分子伴侶功效導致DNA的同時(shí)和間接性損害，造成人體細胞的SOS等多種多樣傳統和非傳統的修補體制，進(jìn)而造成高效率基因突變。

曲霉型水豆豉對感觀(guān)質(zhì)量標準嚴苛，對其機構形狀規定顆粒物詳細、疏松成形，因此其生產(chǎn)制造務(wù)必由整顆黃豆經(jīng)蒸制，以后發(fā)醇做成。因為材料的形狀缺點(diǎn)造成固態(tài)發(fā)酵全過(guò)程中與微生物菌種觸碰室內空間比較有限及對流傳熱不勻稱(chēng)，從而致使了曲霉型水豆豉了曲醅胰蛋白酶魅力較低。因而本論文運用ARTP誘變技術(shù)性培育增產(chǎn)中性蛋白酶魅力米曲霉菌種，并且用整顆黃豆制做復篩培養液開(kāi)展酶活認證，以求提高曲醅的中性蛋白酶魅力，為曲霉型水豆豉非純種發(fā)醇確立一定的理論基礎。

一、原材料和方式

1、菌種

米曲霉（Aspergillus oryzae）NCU一110：從日本生抽釀制用菌粉中剝離而成，經(jīng)擎科生物轉錄組測序，轉錄組測序結果在NCBI網(wǎng)址開(kāi)展BLAST核對后，其開(kāi)放閱讀框與Aspergillus oryzae isolate F8160（Accessionnumber：MN429212.1）達到99.64％，評定為米曲霉，該菌種具備胰蛋白酶系詳細，以產(chǎn)中性蛋白酶為主導的特性?，F階段由江西南昌大學(xué)中法食品工程核心儲藏。

2、實(shí)驗試劑與儀器設備

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸鉀、opo結構脂、三氯乙酸、福林酚試劑、色氨酸、稀鹽酸（均為分析純）：天津大茂化學(xué)藥品廠(chǎng)；TGL一16B型離心機：英國賽默飛世爾科技有限公司；

SP—756P紫外線(xiàn)由此可見(jiàn)光度計：上海市光譜儀器有限責任公司；HWS—250恒溫恒濕設備恒溫箱：上海市幼芽實(shí)驗室儀器有限責任公司。

3、培養液

（1）菌種活化及儲藏培養液：土豆葡萄糖水瓊脂粉培養液（PDA）；

（2）初篩培養液：干酪素4.009，磷酸二氫鉀0.369，磷酸氫二鈉1.079，氯化鎂0.049，氯化鈣0.0029，甘露醇0.59，氧化鈉0.169，硫酸鋁0.0029，胰蛋白胨0.03～0.059，瓊脂粉159，純凈水滴定劑為lL，12l℃殺菌30min；

（3）復篩、酒曲制作培養液：選擇1509高品質(zhì)東北地區大豆，清理后用三倍容積的飲用水于35℃泡浸3h，控干后，121℃殺菌30min；

（4）種曲培養液：麥麩、豆柏、水品質(zhì)占比為：80∶20∶80，500mL三角瓶裝量料509，水40mL，當然pH，121℃殺菌30min；

（5）察氏培養液：硝酸鈉3.09，磷酸氫二鉀1.09，氯化鉀0.59，甘露醇0.59，硫酸鋁0.019，綿白糖209，純凈水1L，將以上藥物按序融解后，添加209瓊脂粉加溫融化，散裝后121℃殺菌30min。

4、 ARTP誘變

（1）米曲霉胞子混液制取

取活性好的米曲霉NCU一110試管嬰兒斜坡，用無(wú)菌檢測鹽水清洗即得胞子懸浮液，抽樣開(kāi)展血球計數板記數，將胞子懸浮液稀釋液至106CFU/mL，預留。

（2） ARTP誘變標準的明確

選用氮氣為工作中汽體，使載片與等離子技術(shù)產(chǎn)生器水射流出入口間隔約2mm，輸出功率為120W，氣總流量10L/min，對10μL胞子懸浮液開(kāi)展誘變解決，設定誘變時(shí)間為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9min。梯度方向稀釋液誘變后胞子懸浮液各自為4.0×10⁴CFU/mL、4.0×10³CFU/mL和4.0×10²CFU/mL，各取100μL施膠于初篩細胞培養皿，30℃遮光控溫塑造3d，測算死亡率，制作至死趨勢圖。

死亡率=（對比菌體數一誘變平板電腦菌體數）/對比菌體數×100％

5、增產(chǎn)中性蛋白酶魅力菌種挑選

（1） 初篩方式

挑選最好誘變時(shí)間下的胞子混液，適度稀釋液（4.0×10²CFU/mL）后施膠于初篩培養液，30℃塑造72h，觀(guān)查每個(gè)培養皿中初篩菌種的全透明圈和菌體尺寸，挑菌菌體比較大而且全透明圈顯著(zhù)的60株米曲霉（序號NCU—A1-A60）單菌體注射于PDA試管嬰兒斜坡，于30℃塑造3～5d，待試管嬰兒中基因突變米曲霉真菌鋪滿(mǎn)淺綠色胞子，將60株米曲霉與初始菌種在初篩培養液上開(kāi)展點(diǎn)種試驗，測算K值并取K值比較大的18株基因突變菌種開(kāi)展下一步復篩試驗。

K=全透明圈直徑／菌體直徑，K值意味著(zhù)了菌種產(chǎn)胰蛋白酶的工作能力，能夠用于分辨基因突變株造成胰蛋白酶魅力的尺寸。

（2）淺盤(pán)酒曲制作復篩增產(chǎn)中性蛋白酶魅力基因突變株

將K值比較大的18株初篩菌種活性，制取胞子懸浮液并稀釋液至107CFU/mL。依據曲霉型水豆豉淺盤(pán)酒曲制作加工工藝，依照1.0％的接種量，早期發(fā)酵溫度操縱在30～34℃，酒曲制作至第一8～24h，黃豆粒表層滿(mǎn)布乳白色真菌，開(kāi)展第一次翻曲；當曲醅發(fā)生品綠胞子時(shí)，開(kāi)展第二次翻曲，溫控在28～32℃。塑造至72h抽樣，選用SB/T 10317—1999中的福林酚測定方法各菌種曲醅中性蛋白酶魅力。

6、基因突變株基因遺傳可靠性認證試驗

將復篩獲得的數株中性蛋白酶魅力明顯提升的基因突變株和初始菌種在PDA試管嬰兒斜坡上30℃連續傳代9次，對以上菌種第一～9代水豆豉曲醅的中性蛋白酶魅力開(kāi)展測量，檢驗復篩菌種的基因遺傳可靠性。