7、基因突變株與初始菌種的生長(cháng)發(fā)育特性及產(chǎn)胰蛋白酶系魅力對比實(shí)驗

（1）菌體形狀對比實(shí)驗

取活性好的基因突變株和初始菌種試管嬰兒斜坡，各自用木簽點(diǎn)種于PDA細胞培養皿核心，30℃靜放塑造，每過(guò)24h觀(guān)查菌體形狀轉變，在無(wú)菌車(chē)間凈化工作臺照相紀錄。

（2）外部經(jīng)濟形狀對比實(shí)驗

選用蓋玻片塑造觀(guān)察，在塑造期內每過(guò)12h取下基因突變株與初始菌種蓋玻片，放置顯微鏡下觀(guān)查并對二者的外部經(jīng)濟形狀開(kāi)展較為。

（3）產(chǎn)胞子工作能力對比實(shí)驗

胞子成分測量參考種曲胞子數測定方法。

取活性好的基因突變株和初始菌種的胞子混液（107CFU／mL）按1.0％注射于種曲培養液中攪拌均勻，在32℃的恒溫箱中沉積塑造。塑造至15h后，將曲料打撒開(kāi)展第一次搖瓶，并減溫至30℃鋪平塑造。大概22h后，將曲料打撒后然后鋪平塑造，期內在第三6、48、60、72和84h開(kāi)展抽樣，測量二者胞子成分。

（4）胰蛋白酶系魅力對比實(shí)驗

將K值比較大的18株初篩菌種活性，制取胞子懸浮液并稀釋液至10⁷CFU／mL。依據曲霉型水豆豉淺盤(pán)酒曲制作加工工藝，依照1.0％的接種量，早期發(fā)酵溫度操縱在30～34℃，酒曲制作至第一8～24h，黃豆粒表層滿(mǎn)布乳白色真菌，開(kāi)展第一次翻曲；當曲醅發(fā)生品綠胞子時(shí)，開(kāi)展第二次翻曲，溫控在28～32℃。塑造至72h抽樣，選用SB/T10317—1999中的福林酚測定方法各菌種曲醅中性蛋白酶魅力fl基因突變株和初始菌種酒曲制作期內，在第24、36、48、60、72和84h開(kāi)展抽樣，胰蛋白酶魅力（中性化、偏堿及酸堿性胰蛋白酶）測量選用SB/T10317一1999中的福林酚法。

8、數據分析

本科學(xué)研究試驗數據信息用EXCEL手機軟件開(kāi)展基本上解決，并且用SPSS20.0手機軟件的0ne—WayANOVA對其顯著(zhù)性差異開(kāi)展剖析；用Origin9.0手機軟件開(kāi)展制圖。

二、結果與剖析

1、米曲霉死亡率曲線(xiàn)圖制作

由圖1得知，伴隨著(zhù)ARTP誘變時(shí)間的增加，其所造成的傷害功效可使菌體死亡率持續上升，在0～1min菌體死亡率升高顯著(zhù)，2～7min增長(cháng)幅度持續減少，7min之后死亡率貼近100％，本試驗至死曲線(xiàn)圖的總體行情與ZhangN、司曉光報導的“馬鞍子型”存活曲線(xiàn)十分符合。當解決的時(shí)間為3min時(shí)，“馬鞍子型”至死曲線(xiàn)圖發(fā)生轉折點(diǎn)的因素可能是誘變時(shí)間的提高造成ARTP對DNA的傷害功效提升，促進(jìn)菌體運行SOS修補體制，其誘發(fā)造成DNA聚合酶IV和V對DNA鏈損害位置的堿基失衡不具有校準作用，SOS不精準修補開(kāi)啟菌體微生物反映體細胞中繁雜的管控互聯(lián)網(wǎng)，導致遺傳信息及新陳代謝路徑的更改，為此來(lái)解決ARTP損害刺激性，菌體死亡率降低。但當損害抗壓強度超出菌體修補體系的極限時(shí)，菌體便會(huì )大批量身亡，因而7min之后菌體死亡率貼近100％。

2、初篩結果

點(diǎn)種取決于調查優(yōu)質(zhì)菌種是不是能在集中的培育中仍能保持較高的中性蛋白酶魅力，而且規定菌種的發(fā)育速度快，對自然環(huán)境適應能力強。菌種正基因突變主要表現為菌體漲勢好而且K值比對比值大。由表1得知，18株初篩菌種的K值均超過(guò)初始菌種，其產(chǎn)中性蛋白酶工作能力很有可能好于初始菌種，在其中菌種NCU—A38、NCU—A55、NCU—A17菌體漲勢不錯，且全透明圈直徑較大，各自為25.6、23.5、23.5mm，而他們的K值則各自實(shí)現了2.08、2.04、1.77。袁艷玲研究表明，根據K值挑選正基因突變株高效率，但菌種的產(chǎn)中性蛋白酶工作能力與K值并并不是呈規律性的線(xiàn)性相關(guān)。因此必須進(jìn)一步的復篩來(lái)明確最后增產(chǎn)中性蛋白酶活的基因突變株，試驗選用淺盤(pán)酒曲制作測量中性蛋白酶活給予認證。

3、復篩結果

圖中融合表1能夠看得出，初始菌種和18株初篩菌種中性蛋白酶魅力尺寸與K值的關(guān)聯(lián)：整體上，酶魅力隨K值的增加而擴大，例如基因突變株NCU—A38、NCUA55、NCU—A17的K值比較大，而且其酶活也明顯高過(guò)別的菌種（JP＜0.05）。在其中基因突變株NU—A38中性化胰蛋白酶魅力最大，為765.4U/g，提升 了25.0％，基因突變株NCU—A55、NCU—A17酶活也各自提升了21.0％、17.0％，成效顯著(zhù)。但有一些K值比較大的菌種例如NCU—A9、NCU—A21，中性蛋白酶魅力并不高。本試驗結果與趙少華等選用紫外線(xiàn)誘變培育氨肽酶增產(chǎn)菌種的分析結果大致同樣，有一些初篩K值比較大的菌種在經(jīng)復篩后其酶促反應反倒不高，從而這也表明了復篩的重要性。依據復篩結果，選擇NCU—A17、NCU—A38、NCU—A55三株中性蛋白酶魅力明顯提升的基因突變株開(kāi)展基因遺傳可靠性認證試驗，最后確認出特性?xún)?yōu)質(zhì)的菌種。