梔子花是木犀科素馨花屬花香綠色植物,可用作茉莉茶的窨制和香辛料獲取。雙瓣茉莉是在我國梔子花種植的首要種類(lèi),其卡羅拉筒分成二輪,花朵雪白,生產(chǎn)量高,芬芳濃,是窨制茉莉茶的具體原材料,具備關(guān)鍵的經(jīng)濟價(jià)值；主莖抗旱性較強,便于種植,也是用以科學(xué)研究的滿(mǎn)意原材料。得到可穩定遺傳的轉基因水稻主莖盡管是科學(xué)研究綠色植物基因功能的主要方式,但因為用時(shí)長(cháng)、成本增加、轉換管理體系不成熟等要素仍限定著(zhù)現如今很多綠色植物種類(lèi)的生物學(xué)科學(xué)研究。瞬間表述技術(shù)性融合報告基因的應用為研究方案基因功能給予了迅速、高效率的方式,擬南芥、香煙、西紅柿、苞米原生質(zhì)細胞,香煙葉肉細胞,香煙BY-2體細胞及其圓蔥表皮細胞等受體的遺傳基因瞬間表述管理體系已被普遍使用于總體目標基因表達、亞細胞定位、啟動(dòng)子及蛋白質(zhì)活力檢驗、蛋白質(zhì)互作等基因功能科學(xué)研究剖析。目前植物細胞的瞬間轉換科學(xué)研究主要是聚集在方式綠色植物,在盆栽花卉綠色植物上的分析相比較少。殊不知,異源受體細胞對同一蛋白質(zhì)的表達作用很有可能存有差別,為了更好地使總體目標基因表達物質(zhì)恰當伸縮,裝飾并精確定位于對應的亞細胞膜的結構,挑選同宗植物細胞瞬間表述剖析可提升分析的精確性。

先人在茉莉花品種形狀特點(diǎn)、香味特點(diǎn)和單方精油獲取層面進(jìn)行了很多科學(xué)研究,但有關(guān)作用遺傳基因在細胞水平層面的探討很少,而有關(guān)梔子花原生質(zhì)體瞬間表述的辦法還末見(jiàn)報導,因而創(chuàng )建梔子花原生質(zhì)體制取和轉換管理體系為廣泛開(kāi)展梔子花細胞水平及分子結構能力的作用基因組研究具備關(guān)鍵實(shí)際意義。本分析根據酶打法分離出來(lái)到很多有魅力的雙瓣茉莉花花朵原生質(zhì)體,應用PEG受體的瞬間轉換管理體系,取得成功評定了3個(gè)梔子花來(lái)源于的總體目標蛋白質(zhì)在原體細胞中的亞細胞定位,為高通量測序進(jìn)行梔子花備選遺傳基因的功能設計打下基礎。

1 原材料與方式

1.1 實(shí)驗原材料

1.1.1 綠色植物原材料

梔子花供試原材料為自然條件下盆栽植物栽種的雙瓣茉莉,源自福建農林高校梔子花種源圃。擬南芥供試原材料為澳大利亞生態(tài)化,由本試驗室人工氣候室培養,生長(cháng)發(fā)育標準為22℃,陽(yáng)光照射13h(22℃),黑喑11h,光照度約80μmol·m^-2·s^-1,環(huán)境濕度60％。擬南芥種籽在4℃冷室春化48h后,挪到溫室大棚出芽,出芽后的種籽挪到陶粒上,按時(shí)灌溉1/4hoAG1AnD培養液。

1.1.2 質(zhì)粒

實(shí)驗常用媒介P35s-GFP來(lái)自體細胞表達載體P2FGW7(6666BP),表述框由花菜花葉病毒(CAmＶ)35s啟動(dòng)子、翠綠色熒光蛋白(GFP)遺傳基因和煙脂堿合酶終止子(nos)組成。質(zhì)粒在大腸埃希菌dh5α菌種中增加后,很多獲取提純質(zhì)粒dnA,電泳原理評定并測量質(zhì)粒dnA濃度值和純凈度,D260nm/d280nm＝1.8～1.9,DnA濃度值為1μG·μ1^-1,-20℃儲存預留。

Js1hY-GFP、JssWEET1-GFP和JssWEET17-GFP媒介：Js1hY、JssWEET1和JssWEET17是福建農林高校園藝花卉學(xué)校伍炳華研究組從梔子花花瓣CDnA中運用RACE引物設計分離出來(lái)復制到的3個(gè)遺傳基因,在其中Js1hY歸屬于mYB轉錄因子大家族的人體生物鐘1hY/CCA1的同宗編號遺傳基因；JssWEET1和JssWEET17歸屬于糖轉運蛋白sWEET大家族的2個(gè)編號遺傳基因。3個(gè)遺傳基因均已亞復制至體細胞表達載體P2GWF7(6670BP)的GFP開(kāi)放閱讀框的閱讀文章框5'端,搭建了Js1hY-GFP、JssWEET1-GFP和JssWEET17-GFP媒介。

1.1.3 實(shí)驗試劑

關(guān)鍵實(shí)驗試劑有纖維素酶(CE11ｕ1AsE‘onoZｕKA’R10,YAKｕ1TPhARmACEｕTiCA1inDｕsTRY)、混凝土離析酶(mACERoZYmE‘onoZｕKA’R10,YAKｕ1TPhARmACEｕTiCA1inDｕsTRY)、果膠酶(PECTinAsE,siGmA)、牛血清蛋白(BsA,siGmA)、mEs(siGmA)、PEG4000(siGmA)、二甲酸熒光素(F1ｕoREsCEindiACETATE,FDA,siGmA)、碘化丙啶(PRoPiDiｕmioDiDE,Pi,siGmA)。其他基本上實(shí)驗試劑均購自生工生物企業(yè)。

1.2 外植體原材料的解決

參考YooETA1的方式 ,選擇生長(cháng)發(fā)育5～6周的擬南芥出葉中徹底屈伸的葉子,或當然盆栽植物下三年生梔子花主莖的葉子,用單層刀頭將葉子切割成寬約0.5～1.0mm的細條,與酶液充足攪拌后,開(kāi)展原生質(zhì)體分離出來(lái)。

本實(shí)驗還采用綻放的梔子花花朵做為分離出來(lái)原生質(zhì)體的酶解原材料,并參考YooETA1、WｕETA1和ZhEnGETA1的方式 ,選用不一樣的處理方法,文中取名為切條法、膠撕法和磨紗法,較為對梔子花花朵原生質(zhì)體分離出來(lái)效果的危害。選擇3～5朵新鮮對外開(kāi)放的花瓣0.1～0.4G,選用不一樣的處理方法使花朵體細胞曝露：A切條法,用刮刀將花朵切割成總寬為0.5～1.0mm細條條；B膠撕法,用透明膠帶黏住花朵正反兩面,輕輕地撕下粘在下外皮上的膠布,使花朵體細胞曝露；C磨紗法,用特細石英沙輕輕地磨擦花朵下外皮,導致外皮輕度損壞顯現出花朵體細胞。解決后的花朵機構馬上挪到酶液中,開(kāi)展原生質(zhì)體分離出來(lái),每一個(gè)解決實(shí)驗設定3個(gè)分子生物學(xué)反復,各自統計分析花朵原生質(zhì)體生產(chǎn)量和活力。

1.3 原生質(zhì)體的剝離方式

葉子或花朵原生質(zhì)體的配制方式參考YooETA1的方式 ,并略做改動(dòng),將解決后的綠色植物原材料泡浸于含15G·1^-1纖維素酶和4G·1^-1混凝土離析酶的酶解液中,酶有機溶劑為20mmol·1^-1KC1,0.4mol·1^-1甘油果糖,20mmol·1^-1mEsPh5.7,10mmol·1^-1CAC12和1G·1^-1BsA的溶液,真空包裝解決30min后,在25℃黑喑情況下靜放酶解4h,以后放置水準震蕩器內以200R·min^-1的轉速比波動(dòng)10min,使原生質(zhì)體充足釋放出來(lái)到酶解液中。向酶解溶液中添加等大小的W5水溶液(154mmol·1^-1nAC1,125mmol·1^-1CAC12,5mmol·1^-1KC1,2mmol·1^-1mEsPh5.7),經(jīng)200目沙布過(guò)慮后,于200G,4℃離心式3min,棄上清搜集原生質(zhì)體,以后再添加2m1的W5,靜放冰面40min,清除上清后,添加2m1W5水溶液重懸,測量原生質(zhì)體總產(chǎn)量。

為提升末莉花朵原生質(zhì)體的剝離高效率,將切條法處置后的花朵機構放置含一定濃度梯度纖維素酶或果膠酶的酶解液中,黑喑情況下酶解3～6h,在顯微鏡下統計分析原生質(zhì)體生產(chǎn)量和致死率,明確合適的酶液組成和酶解時(shí)間,實(shí)驗反復3次。應用熒光染料Pi檢驗原生質(zhì)體的致死率。向100μ1搜集的原生質(zhì)體中添加1μ1Pi水溶液(100μG·m1^-1)攪拌,取10μ1至蓋玻片上,在光學(xué)顯微鏡下統計分析一個(gè)視線(xiàn)中傳出鮮紅色瑩光數據信號的原生質(zhì)體數量和白光燈視線(xiàn)下原生質(zhì)體的總數量,觀(guān)查視線(xiàn)5～10個(gè),原生質(zhì)體致死率/％＝(發(fā)鮮紅色瑩光的體細胞數/原生質(zhì)體數量)×100。

1.4 原生質(zhì)體的總產(chǎn)量與活力測量

生產(chǎn)量測量：根據血球計數板記數。搜集的原生質(zhì)休重懸在W5水溶液中,取小量滴于0.1mm血球計數板上,在顯微鏡下觀(guān)查,選擇膜結構工程詳細的原生質(zhì)體記數,每一個(gè)試品記數3個(gè)反復,取均值,統計分析原生質(zhì)體生產(chǎn)量?；煲褐性|(zhì)體濃度值/(個(gè)·m1^-1)＝血球計數板均值每一個(gè)大格子(0.1mm3,即0.1μ1)的原生質(zhì)體數量×104。原生質(zhì)體生產(chǎn)量,即1克生物量原材料所得的的原生質(zhì)體數量/(個(gè)·G^-1)＝原生質(zhì)體的濃度值(個(gè)·m1^-1)×飄浮原生質(zhì)體的W5水溶液容積(m1)/花朵品質(zhì)(G)。

活力測量：選用FDA活物染色法。每100μ1飄浮的原生質(zhì)體中添加1μ1FDA上色液(5mG·m1^-1融解于甲苯),取10μ1放置蓋玻片上,在光學(xué)顯微鏡下檢測其活力,魅力高的原生質(zhì)體在瑩光下顯微鏡下可傳出淺綠色瑩光。

1.5 原生質(zhì)體的瞬間轉換

將沉積后的原生質(zhì)體用mmG水溶液(0.4mol·1^-1甘油果糖,15mmol·1-1mGC12,4mmol·1^-1mEsPh5.7)重懸,使其含量做到2×10五個(gè)·m1^-1,用以PEG受體的基因遺傳轉換。每100μ1原生質(zhì)體試品與10μ1外源性質(zhì)粒dnA(1μG·μ1^–1)及其110μ1PEG水溶液[400G·1^-1PEG4000,0.2mol·1^-1甘油果糖,0.1mol·1^-1CAC12]充足混合后,室內溫度靜放5min,添加440μ1W5水溶液中止反映,200G離心式棄上清.用100μ1W1水溶液(0.5mol·1^-1甘油果糖,20mmol·1^-1KC1,4mmol·1^-1mEsPh5.7)重懸原生質(zhì)體,22℃黑喑情況下塑造12～16h,可觀(guān)查原生質(zhì)體轉換高效率或總體目標蛋白質(zhì)的亞細胞定位。

為改進(jìn)末莉花朵原生質(zhì)體的轉換高效率,將分離純化后的花朵原生質(zhì)休重懸成不一樣含量的細胞液,向轉換管理體系中添加不一樣量的P35s-GFP質(zhì)粒dnA,與等大小的不一樣濃度值的PEG水溶液柔和攪拌,使轉換機制的PEG終濃度值分別為50、100、150、200和250G·1-1,室內溫度靜放各自解決2、5、10、15和30min,轉換后的原生質(zhì)體在黑暗中孵育16h,在顯微鏡下統計分析轉換高效率,實(shí)驗反復3次.轉換高效率檢驗:向100μ1轉換后的原生質(zhì)體添加1μ1Pi水溶液,取10μ1至蓋玻片上,在光學(xué)顯微鏡下統計分析一個(gè)視線(xiàn)中傳出鮮紅色瑩光數據信號的原生質(zhì)體數量,表述翠綠色熒光蛋白的原生質(zhì)體數量和白光燈視線(xiàn)下原生質(zhì)體的總數量,觀(guān)查視線(xiàn)5～10個(gè),原生質(zhì)體轉換高效率/％＝[發(fā)翠綠色瑩光的原生質(zhì)體數/(原生質(zhì)體數量-Pi上色發(fā)鮮紅色瑩光的體細胞數)]×100。

1.6 共聚焦顯微鏡觀(guān)察體細胞精準定位

含總體目標遺傳基因的瞬間表達載體轉到原生質(zhì)體,孵育16h后,從管底汲取10μ1原生質(zhì)體水溶液放置蓋玻片上,用1EiCATCssP8激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察總體目標基因表達狀況。用以觀(guān)查GFP數據信號的熒光激起光的波長(cháng)為488nm,發(fā)送光波長(cháng)為505～535nm；觀(guān)查葉綠體自發(fā)性瑩光的激起光的波長(cháng)為633nm,發(fā)送光波長(cháng)為647～685nm。