（5）抗菌成分的胰蛋白酶水解作用試驗

選用兩層瓊脂粉蔓延法，將10mL殺菌素瓊脂粉固體培養基倒進(jìn)無(wú)菌檢測細胞培養皿中，待徹底凝結后做為最底層培養液，每皿按方形四角部位輕放進(jìn)4個(gè)無(wú)菌檢測牛津杯，將0.1mL濃度值為l×10⁸CFU／mL的標示菌液加至10mL制冷至45～50℃的LB固體培養基中，當心攪拌后倒至最底層培養液上，留意不能加到牛津杯里，待其徹底凝結，做為菌層培養液。當心取下牛津杯，留意不能影響已產(chǎn)生的孔眼，向直徑大約為8mm孔眼內添加待檢CFS，37℃厭氧發(fā)酵塑造18h后，精確測量抑菌圈直徑。選用大腸埃希菌和金黃鏈球菌做為指示菌，與此同時(shí)用鹽水做為對比。選擇抑菌圈較大的乳酸菌飲料菌種作事后科學(xué)研究抗菌試驗中抑菌圈較大的乳酸菌飲料菌種CFS，各自調整pn為胰蛋白酶K、胃蛋白酶和蛋白酶的適宜功效pH，按1.0mg／mL各自添加胰蛋白酶K(適宜pH7.0)、胃蛋白酶(適宜pH2.0)、蛋白酶(適宜pH7.0)，37℃下溫育1h，將CFS的pH調返回5.0，牛津杯法精確測量其抑菌圈直徑，反復3次，以沒(méi)經(jīng)胰蛋白酶解決過(guò)的pH=5.0的CFS為對比。認證乳酸菌飲料CFS的抗菌活性物質(zhì)是不是為蛋白質(zhì)類(lèi)。

（6）乳酸菌飲料組織學(xué)特點(diǎn)觀(guān)查

選用兩層瓊脂粉蔓延法，將10mL殺菌素瓊脂粉固體培養基倒進(jìn)無(wú)菌檢測細胞培養皿中，待徹底凝結后做為最底層培養液，每皿按方形四角部位輕放進(jìn)4個(gè)無(wú)菌檢測牛津杯，將0.1mL濃度值為l×10⁸CFU／mL的標示菌液加至10mL制冷至45～50℃的LB固體培養基中，當心攪拌后倒至最底層培養液上，留意不能加到牛津杯里，待其徹底凝結，做為菌層培養液。當心取下牛津杯，留意不能影響已產(chǎn)生的孔眼，向直徑大約為8mm孔眼內添加待檢CFS，37℃厭氧發(fā)酵塑造18h后，精確測量抑菌圈直徑。選用大腸埃希菌和金黃鏈球菌做為指示菌，與此同時(shí)用鹽水做為對比?？咕囼炛幸志^大的乳酸菌飲料菌種注射于MRS固態(tài)平板電腦上四劃分線(xiàn)，37℃厭氧發(fā)酵塑造48h，觀(guān)查固態(tài)平板電腦上的菌體形狀特點(diǎn)并挑菌單菌體開(kāi)展革蘭氏染色試驗，鏡檢查觀(guān)查菌體上色結果和組織學(xué)特點(diǎn)。

（7）菌種鑒定

①生理學(xué)生物化學(xué)評定試驗

參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《乳酸細菌分類(lèi)鑒定及實(shí)驗方法》中的實(shí)驗方法，選用兩層瓊脂粉蔓延法，將10mL殺菌素瓊脂粉固體培養基倒進(jìn)無(wú)菌檢測細胞培養皿中，待徹底凝結后做為最底層培養液，每皿按方形四角部位輕放進(jìn)4個(gè)無(wú)菌檢測牛津杯，將0.1mL濃度值為l×10⁸CFU／mL的標示菌液加至10mL制冷至45～50℃的LB固體培養基中，當心攪拌后倒至最底層培養液上，留意不能加到牛津杯里，待其徹底凝結，做為菌層培養液。當心取下牛津杯，留意不能影響已產(chǎn)生的孔眼，向直徑大約為8mm孔眼內添加待檢CFS，37℃厭氧發(fā)酵塑造18h后，精確測量抑菌圈直徑。選用大腸埃希菌和金黃鏈球菌做為指示菌，與此同時(shí)用鹽水做為對比?？咕囼炛幸志^大的乳酸菌飲料菌種開(kāi)展生理學(xué)生物化學(xué)評定。

②16SrRNA遺傳基因保守序列增加

選用兩層瓊脂粉蔓延法，將10mL殺菌素瓊脂粉固體培養基倒進(jìn)無(wú)菌檢測細胞培養皿中，待徹底凝結后做為最底層培養液，每皿按方形四角部位輕放進(jìn)4個(gè)無(wú)菌檢測牛津杯，將0.1mL濃度值為l×10⁸CFU／mL的標示菌液加至10mL制冷至45～50℃的LB固體培養基中，當心攪拌后倒至最底層培養液上，留意不能加到牛津杯里，待其徹底凝結，做為菌層培養液。當心取下牛津杯，留意不能影響已產(chǎn)生的孔眼，向直徑大約為8mm孔眼內添加待檢CFS，37℃厭氧發(fā)酵塑造18h后，精確測量抑菌圈直徑。選用大腸埃希菌和金黃鏈球菌做為指示菌，與此同時(shí)用鹽水做為對比。

將抗菌試驗中抑菌圈較大的乳酸菌飲料菌種開(kāi)展病菌基因的獲取，依照已買(mǎi)病菌DNA獲取檢測試劑盒使用說(shuō)明試驗操作流程開(kāi)展。

③菌種鑒定并搭建系統軟件進(jìn)化樹(shù)

取5μL增加精彩片段100V工作電壓下，1％瓊脂糖電泳原理觀(guān)查結果(尺寸應是1500bp上下)。認證后的電泳條帶膠回收利用檢測試劑盒回收利用，回收利用物質(zhì)送上海生工生物技術(shù)有限責任公司轉錄組測序。將菌種16SrRNA高通量測序結果與GenBank數據庫查詢(xún)中已經(jīng)知道菌種保守序列開(kāi)展核對，根據MEGAX手機軟件剖析目地基因序列的開(kāi)放閱讀框，并搭建系統發(fā)育樹(shù)。

4、數據處理方法

每一個(gè)試驗3個(gè)平行面，數據信息用x^–±s表明。

二、結果與剖析

1、乳酸菌飲料菌種分離出來(lái)

從安徽省當地酸菜中國共產(chǎn)黨分離出來(lái)得到10個(gè)溶鈣圈的乳白色單菌體，經(jīng)初始評定得到6株乳酸菌飲料，進(jìn)一步挑選提純后依照菌種來(lái)源于和挑菌次序取名。

2、抗菌試驗結果

抗菌試驗結果如圖所示1所顯示，菌種PC-3對2種指示菌抑菌圈直徑較大，抗菌實(shí)際效果最好是，對大腸埃希菌和金黃鏈球菌的抑菌圈直徑各自做到17.17 0.42mm和19.23±0.61mm。結果顯示該菌種對大腸埃希菌和金黃鏈球菌有極強的殺菌作用。緣故可能是乳酸菌飲料在成長(cháng)新陳代謝的環(huán)節中形成了有機物、H₂0₂或病菌素，進(jìn)而控制了標示病菌的生長(cháng)發(fā)育。挑選PC-3號菌種做為事后試驗菌種。

3、菌種PC-3生長(cháng)曲線(xiàn)圖和產(chǎn)酸曲線(xiàn)圖的測量

菌種PC-3生長(cháng)曲線(xiàn)圖和產(chǎn)酸曲線(xiàn)圖如圖2所顯示，該菌種在0～12h處在延滯期，生長(cháng)發(fā)育遲緩，延滯期相比較長(cháng)。菌種PC-3在12h后進(jìn)到對數期，菌體細胞快速繁衍生長(cháng)發(fā)育，在36h菌體細胞數做到最高值。在菌體進(jìn)到多數成長(cháng)期后菌液的pH快速減少，穩定型時(shí)pH保持在4.0上下。
 

4、有機物和雙氧水清除抗菌試驗結果

菌種PC-3CFS對二種指示菌的抑制效果，可能是菌種PC-3新陳代謝生成的病菌素或酸堿性尾端物質(zhì)如有機物或雙氧水功效的結果。如圖所示3所顯示，pH=5.0的菌種Pc-3CFS與初始CFS抗菌實(shí)際效果對比，對大腸埃希菌和金黃鏈球菌的抑菌圈直徑各自降低了7.0％和6.6％，表明pH=5.0的菌種Pc-3CFS與初始CFS抗菌實(shí)際效果相仿，事后實(shí)驗中抗菌實(shí)際效果比較能夠 pH=5.0做為pH調整標準；pH=5.0的乳酸菌和甲酸對照實(shí)驗對二種指示菌的抑菌圈直徑顯著(zhù)減少，抗菌實(shí)際效果非常明顯變弱，表明清除乳酸菌和甲酸的影響后，CFS中還出現別的抗菌化學(xué)物質(zhì)，菌種PC-3CFS中起關(guān)鍵殺菌作用的化學(xué)物質(zhì)并不是有機物類(lèi)。