香菜為葉菜，其表層微生物菌種總數多，類(lèi)型繁雜。微生物菌種的浸染不但會(huì )危害香菜的外型，本質(zhì)上也減少了服用使用價(jià)值，降低貨架期時(shí)間”。香菜栽種的土壤層、氣侯等自然環(huán)境情況不一樣，伴隨著(zhù)栽培技術(shù)的提升與標準的擴張，現切生產(chǎn)加工經(jīng)營(yíng)規模的不斷發(fā)展，從農田到餐桌椅的階段增加，這種都提升了現切香菜微生物菌種環(huán)境污染的風(fēng)險性，也增多了微生物菌種操縱的難度系數。

氫氧化鈣、氫氣、次氯酸鈣等能在水中造成次氯酸鈉的農藥殺菌劑總稱(chēng)之為有效氯農藥殺菌劑，在其中次氯酸鈉是現階段使用最普遍的有效氯農藥殺菌劑。此農藥殺菌劑以氯為主導，在溶液中產(chǎn)生有強氧化性的次氯酸鈉，次氯酸鈉穿透微生物菌種的細胞質(zhì)進(jìn)入體細胞，與胞內蛋白質(zhì)造成鈦酸異丙酯反映進(jìn)而凝結細胞液，可高效殺掉病菌，實(shí)際效果顯著(zhù)且反應靈敏?，F階段，許多公司具體應用氫氧化鈣做為農藥殺菌劑，并關(guān)鍵檢測菌落總數與大腸桿菌的調節狀況。因為氫氧化鈣很有可能存有氯殘余而對身體健康造成傷害嘲，因而必須 擴大翠綠色可靠的農藥殺菌劑類(lèi)型，持續發(fā)掘新的農藥殺菌劑并嚴控其應用濃度值。

次氯酸鈉溶液是一種酸堿性氧化劑，可溶強電解質(zhì)、酒精、醫用乙醚、鹽酸等有機溶劑，有很強的刺激怪味，對人的雙眼、肌膚、粘膜和呼吸道有刺激效果，特性不穩定，受熱或有機化合物、金屬離子、強酸等易溶解。

次氯酸鈉溶液可消滅細菌繁殖體、細菌、病毒感染、分枝桿菌、細菌芽孢等微生物菌種，且在較低溫度下仍合理，其滅菌實(shí)際效果受濃度值、溫度、空氣濕度、有機化合物等要素危害網(wǎng)。次氯酸鈉溶液在濃度值為50mg/1下就能實(shí)現較好的滅菌實(shí)際效果，基本上對全部現切蔬菜水果表層的腐壞菌和病原菌有顯著(zhù)抑止實(shí)際效果，但因其穿透性不強，較低濃度的下雖對飄浮的微生物菌種實(shí)際效果顯著(zhù)，而對牢牢地吸咐在現切商品表層的生物功效不顯著(zhù)嘲。次氯酸鈉溶液反映的副產(chǎn)品是水和O2，對身體和自然環(huán)境無(wú)毒性沒(méi)害，因而被覺(jué)得是一種環(huán)保節能的農藥殺菌劑，FDA已經(jīng)將其列入非清洗食品類(lèi)觸碰表層消毒殺菌劑。次氯酸鈉溶液做為氯系農藥殺菌劑的代替品，在現切蔬菜水果生產(chǎn)加工中獲得普遍科學(xué)研究與運用。

與含氯制劑對比，二氧化氯不容易與有機化合物反映轉化成致癌物質(zhì)、致基因突變、胎兒畸形的化學(xué)物質(zhì)，是現在世界上認可。的全新一代高效率、廣譜性、安全性的除菌防腐劑同。它能快速空氣氧化病毒蛋白質(zhì)衣殼中的色氨酸，抑止疫情的非特異吸咐，阻攔其對靶細胞的浸染，還能與病菌以及他微生物菌種蛋白中的一部分碳水化合物產(chǎn)生氧化還原反應反映，溶解毀壞碳水化合物，抑止微生物菌種蛋白質(zhì)合成，進(jìn)而造成 微生物菌種身亡。很多歐洲國家相關(guān)機構已許可和強烈推薦二氧化氯用以食物的消毒殺菌、防腐蝕、冷藏等，世衛組織(WH0)已將二氧化氯列入A1級安全性高效消毒劑，在我國衛生計生委也已準許二氧化氯為消毒液和新式食用添加劑。

以上3種減菌劑在現切香菜中的減菌實(shí)際效果還欠缺科學(xué)研究，因而創(chuàng )作者選用氫氧化鈣、二氧化氯和次氯酸鈉溶液解決現切香菜，明確合適于現切蕪荽的最好減菌劑，根據16SrDNA全基因組測序技術(shù)檢查鑒定現切香菜表層細菌種類(lèi)，剖析關(guān)鍵發(fā)病與致腐病菌，以求更合理地提升現切香菜商品的安全系數。

1 原材料與方式

1.1 實(shí)驗原材料

香菜：市面上。

1.2 關(guān)鍵實(shí)驗試劑及儀器設備

1.2.1 關(guān)鍵實(shí)驗試劑

氫氧化鈣、二氧化氯、次氯酸鈉溶液、氧化鈉、胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖水、瓊脂粉、乳清蛋白、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、月桂酸硝酸鈉、煌綠乳清蛋白膽鹽骨頭湯培養液、氫氧化鈉溶液、硫酸、酒精、牛肉膏、蛋白胨、結晶紫、草酸銨、碘片、碘酸鉀、番紅、松柏樹(shù)油、SK1201-UN10-10立柱式病菌基因DNA抽提檢測試劑盒等。

1.2.2 關(guān)鍵儀器設備

DJ300高精密電子分析天平：北京市賽多利斯儀器設備系統軟件有限責任公司商品；YXQ-SG41-280手提工作壓力蒸汽滅菌鍋：上海市華線(xiàn)醫療反物質(zhì)儀器設備有限責任公司商品：SW-CJ-1FD凈化工作臺：蘇凈集團蘇州市萬(wàn)通氣體技術(shù)性有限責任公司商品；GRP-9160型防水防火式恒溫培養箱：上海森信實(shí)驗室儀器有限責任公司商品；XW-80A小型漩渦混和儀：上海市滬西剖析儀器廠(chǎng)有限責任公司商品：HH-6數顯式恒溫水浴鍋：常州市國華家用電器有限責任公司商品：SPX-320型智能化生化培養箱：寧波市江南地區儀器廠(chǎng)商品；PCR反映增加儀：澳大利亞BBI企業(yè)商品：3730轉錄組測序檢測儀：美罔ABI企業(yè)商品；H6-1小型電泳槽：上海市精益求精有機玻璃板產(chǎn)品儀器廠(chǎng)商品；凝膠成像系統軟件：GeneGenius企業(yè)商品。

1.3 實(shí)驗方式

1.3.1 試品及減菌劑的提前準備

選擇無(wú)枯黃、無(wú)機械設備傷、無(wú)病害、新鮮程度基本一致的當地現切香菜，去根，冷水洗至可立即服用，晾曬至無(wú)水跡，備用。

氫氧化鈣(5.2mg/1)配置成濃度值為0、50、100、150、200、250mg/1的水溶液，測量pH各自為6.32、10.33、11.37、11.70、11.90、12.07。

二氧化氯(8mg/1)配置成濃度值為0、20、40、60、80、100mg/1的水溶液，測量pH各自為5.90、3.16、2.87、2.73、2.56、2.41。

次氯酸鈉溶液(15.7mg/1)，由A液(醋酸和鹽酸)和B液(雙氧水)以容積比10:8制取1000mg/1水溶液，反映24h后稀釋液成0、50、100、150、200、250mg/1，測量PH各自為6.93、4.79、4.03、3.78、3.60、3.52。
1.3.23種減菌劑解決

較為3種減菌劑減菌實(shí)際效果，挑選實(shí)際效果最好的減菌劑，以提升減菌劑解決主要參數。3種減菌劑解決標準見(jiàn)表1。全部解決在常溫下開(kāi)展，每一個(gè)解決反復3次。

1.3.3 二氧化氯正交和解決

依照1₉(3⁴)正交表，對解決濃度值(20、40、60mg/1)、解決時(shí)間(2、5、10min)、水菜容積質(zhì)量比(4m1:1g、8m1:1g、12m1:1g)三要素開(kāi)展正交實(shí)驗，對照實(shí)驗為冷水洗前及冷水洗后備用的試品。正交試驗表見(jiàn)表2。

1.4 測量指標值與方式

1.4.1 菌落總數

參考GB/T4789.2-2016。

1.4.2 大腸桿菌

參考GB/T4789.3-2016。

1.5 病菌的分離純化與儲藏

無(wú)菌檢測自然環(huán)境下，稱(chēng)量25g現切香菜置盛有225m1無(wú)菌檢測鹽水的錐形瓶中，放置搖床80r/min，搖晃20min，馬上將試品液稀釋液至1×10^-3、1×10^-1、1×10^-5二三個(gè)梯度方向，汲取1m1試品勻液于無(wú)菌檢測培養皿內，每一個(gè)稀釋液度做兩個(gè)反復與此同時(shí)，各自汲取1m1無(wú)菌檢測鹽水添加兩個(gè)無(wú)菌檢測培養皿內作空白試驗。立即將牛肉膏蛋白胨培養液竭盡培養皿，并旋轉培養皿使其混和勻稱(chēng)。于(36±1)℃顛倒控溫塑造(48±2)h。實(shí)驗反復3次、觀(guān)查病菌的成長(cháng)狀況及菌體的顏色和特點(diǎn)，并選擇優(yōu)點(diǎn)菌挑菌單菌體，選用平板劃線(xiàn)法于牛肉膏蛋白胨培養液畫(huà)線(xiàn)提純。于(36±1)℃顛倒控溫塑造(48±2)h。持續提純5代。

挑菌提純第5代的單菌體注射于牛肉膏蛋白胨斜坡，于(36±1)℃顛倒控溫塑造(24±2)h。放置4℃冰柜中儲藏。

1.6 病菌形狀觀(guān)查

1.6.1 簡(jiǎn)落形狀觀(guān)祭

觀(guān)查提純第5代平皿內菌體尺寸、菌體形狀、菌體色調、菌體表層特點(diǎn)(光潔是否、干躁是否、是不是突起、是不是全透明、是不是存有同舟環(huán)等)、邊沿標準是否。

1.6.2 革蘭氏染色

參考CB/T4789.28-2013。

1.7 16SrDNA序列的剖析以及系統發(fā)育樹(shù)的創(chuàng )建

1.7.1 DNA獲取

參考上海生工SK1201-UNIQ-10立柱式病菌基兇組DNA抽提檢測試劑盒使用說(shuō)明書(shū)實(shí)際操作。

1.7.2 PCR擴增病菌的16SrDNA序列

1) 引物設計編碼序列

正方向引物設計27F：5’-AGACTTTCATCCTGGCTCAG-37；反方向引物設計1492R(1510)：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

2) PCR反映管理體系創(chuàng )建(50μ1)

模版DNA10pmo1，上游引物1μ1，中下游引物設計1μ1，dNTPMix1μ1，10×TaqreactionBuffer5μ1，高保真音響聚合酶(5U/μ1)0.25μ1，無(wú)菌檢測超純水系統補充至50μ1。

3) PCR程序流程設置

98℃預轉性5min：95℃轉性35s，55℃淬火35s，72℃拓寬90s，3五個(gè)循環(huán)系統；拓寬8min。

1.8 屬種評定

將PCR物質(zhì)送至轉錄組測序企業(yè)開(kāi)展轉錄組測序。將轉錄組測序進(jìn)行的16SrDNA序列在GenBank(NCBI)中開(kāi)展B1AST查找，找尋類(lèi)似編碼序列并免費下載，用MEGA制作軟件系統發(fā)育樹(shù)明確病菌屬種。

1.9 數據處理方法

數據信息取3次反復均值，選用Exce1、SPSS18.0、正交設計小助手等手機軟件對信息開(kāi)展剖析。