1、實(shí)驗目的

(1)了解流動(dòng)相中pH值變化對分離組分的影響。

(2)熟練掌握工作曲線(xiàn)法定量法，同時(shí)了解其他定量方法。

(3)了解HPLC在分析化工產(chǎn)品方面的應用。

2、實(shí)驗原理

對硝基甲苯酸(p-NBA)是很重要的藥物合成中間體，如將p-NBA還原，可產(chǎn)生對氨基苯甲酸。p-NBA的純度對產(chǎn)品的產(chǎn)率影響很大，一般要求p-NBA的純度要在99.5％以上。然而，p-NBA中總是含有少量(約0.5％)的異構體雜質(zhì)鄰硝基苯甲酸(o-NBA)和間硝基苯甲酸(m—NBA)。因此，要準確定量p-NBA，首先要將這幾種異構體分離。

本實(shí)驗采用反相HPLC分離這3種異構體，分離的原理是基于異構體之間極性的微弱差異，在甲醇(或異丙醇)和水中的溶解度有微小的不同(分配系數不同)，因而有可能實(shí)現三者的分離。

NBA是有機酸，在水中可部分離解成酸根陰離子，使之在流動(dòng)相中的分配系數變得很大，在反相鍵合固定相C₁₈中的保留變小，異構體相互之間可能完全不能分離。因此，在流動(dòng)相中需加入有機酸以抑制NBA的解離，這是實(shí)現分離的關(guān)鍵。本實(shí)驗在流動(dòng)相中加入醋酸就是這個(gè)目的。各種異構體可通過(guò)與標準樣品的保留時(shí)間對照進(jìn)行定性，采用工作曲線(xiàn)法定量。

3、儀器與試劑

儀器：高效液相色譜儀、紫外檢測器、流動(dòng)相脫氣裝置。

試劑：o-NBA，m-NBA，p-NBA：分析純；

p-NBA：市售工業(yè)品；

異丙醇、乙醇：分析純；

醋酸：分析純；

水：重蒸去離子水。

4、實(shí)驗內容與步驟

(1)按儀器操作說(shuō)明開(kāi)機，使儀器處于工作狀態(tài)。

(2)設置色譜參數：Micropak C₁₈色譜柱(Ø4.6mm×150mm，5μm)；流動(dòng)相 (A)為異丙醇：水=20：80(體積比)；流動(dòng)相(B)為異丙醇：水：醋酸=20： 80：0.4(體積比)，pH值約為2～3；流速1.2mL/min；色譜柱溫度為30℃；紫外檢測波長(cháng)為254nm。

(3)配置樣品：分別配置約1000mg/L的o-NBA，m-NBA，p-NBA的乙醇溶液；配置o-NBA，m-NBA，p-NBA混合物標樣(以質(zhì)量濃度計)；配置工業(yè)品p-NBA的乙醇溶液(約500mg/L)；配置p-NBA標準系列濃度溶液(50～1000mg/L)。

(4)先用流動(dòng)相(A)，待基線(xiàn)穩定后，通過(guò)六通閥注入混合標樣，當樣品中所有色譜峰出完后，即可停止分析。

(5)改用流動(dòng)相(B)，再次注入混合標樣。比較兩種流動(dòng)相的分離效果。

(6)在最佳分離條件下分別注入o-NBA，m-NBA和p-NBA標樣，用保留時(shí)間對混合物中3種異構體進(jìn)行定性并記錄峰面積。

(7)利用標準p-NBA系列濃度溶液，作濃度一峰面積工作曲線(xiàn)。

(8)注入已配置的混合標樣，重復3次(峰面積誤差小于3％)，取平均值計算校正因子。

(9)注入市售工業(yè)品p-NBA樣品溶液，重復3次(峰面積誤差小于3％)，取平均值。

5、注意事項

(1)按實(shí)驗室提供的儀器操作規程操作儀器。

(2)流動(dòng)相中pH值可按實(shí)際分離情況進(jìn)行調節。

6、數據處理

(1)將流動(dòng)相中含醋酸與不含醋酸時(shí)各異構體的保留時(shí)間、峰高或峰面積整理成表，比較兩種情況下的分離效果(以分離度表示)，并簡(jiǎn)述原因。

(2)用3種方法計算市售工業(yè)品p-NBA的純度(分別用工作曲線(xiàn)法、外標法和歸一法計算)。

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