羊肚菌是四大名貴食用菌之一，因其菌蓋表面有許多不規則凹陷且多有褶皺，狀似羊肚而得名，主要分布在云南、貴州、青海、西藏等地。羊肚菌肉質(zhì)鮮美，風(fēng)味獨特，營(yíng)養豐富，富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、多糖等物質(zhì)，有提高免疫力、抗癌等藥用價(jià)值。氨基酸作為蛋白質(zhì)的基本組成單元和人體的所需營(yíng)養成分，具有多種不同的生理功能，能判斷食品的營(yíng)養價(jià)值，同樣也關(guān)聯(lián)和影響食品的風(fēng)味，是食品質(zhì)量評價(jià)的重要指標，所以羊肚菌中氨基酸的含量是衡量羊肚菌品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標。

在國家標準GB/T5009.124-2016中，測定氨基酸采用外標法，吳素蕊、張航、黃世群等對羊肚菌氨基酸的研究多數均采用外標法，但該方法不能消除實(shí)驗中的誤差以及標準品與待測樣品之間的基體差異所導致的基質(zhì)效應，對實(shí)驗結果的準確度有一定影響；內標法由于內標物質(zhì)和待測組分來(lái)自同一基體，當實(shí)驗條件發(fā)生非人為變化時(shí)，兩者會(huì )受到相同影響，消除了系統誤差，使分析更加準確。為了更好地評價(jià)羊肚菌的品質(zhì)，需對羊肚菌中氨基酸的含量進(jìn)行全面、準確的控制，但檢測物質(zhì)較多，成本過(guò)高且耗時(shí)過(guò)長(cháng)。QAMS法通過(guò)測定一個(gè)成分而實(shí)現多個(gè)成分的同步測定，大幅度降低成本和實(shí)驗人員的工作量，比傳統質(zhì)量控制方法更加經(jīng)濟、高效、簡(jiǎn)單。

本研究采用一測多評法測定羊肚菌中17種氨基酸的含量，并對云南、新疆、貴州等6個(gè)不同地區的羊肚菌測定研究，本文為衡量羊肚菌的食用價(jià)值和品質(zhì)優(yōu)劣提供了科學(xué)依據，為羊肚菌的開(kāi)發(fā)利用指明了方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肚菌采集于新疆伊犁州、云南麗江市、貴州劍河縣、貴州銅仁市萬(wàn)山區、貴州貴陽(yáng)市長(cháng)坡嶺森林公園、貴州貴陽(yáng)市烏當區長(cháng)坡六個(gè)地區，羊肚菌置于干燥箱70℃烘干后，粉碎處理，過(guò)60目篩，粉末密封待用；甲醇、乙腈、三乙胺、正己烷　均為色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；異硫氰酸酯（PITC）純度大于98%，上海麥克林生化科技有限公司；乙酸銨、冰醋酸　均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；超純水　自制；18種氨基酸[天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、精氨酸（Arg）、蘇氨酸（Thr）、纈氨酸（Val）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、甘氨酸（Gly）、組氨酸（His）、丙氨酸（Ala）、甲硫氨酸（Met）、賴(lài)氨酸（Lys）、脯氨酸（Pro）、絲氨酸（Ser）、茶氨酸（The）]　純度均大于98%，北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司。
Agilent1100高效液相色譜儀（方法學(xué)考察所用）、Agilent1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；DZKW-電熱恒溫水浴鍋，天津天泰儀器有限公司；200T粉碎機，永康鉑歐五金制品有限公司；AL-104電子天平，梅特勒-托利多公司；CH-250超聲波清洗機，北京創(chuàng )新德超聲電子研究所；DiscoveryDV215CD分析天平，上海奧豪斯儀器有限公司；202-1型恒溫干燥箱　上海實(shí)驗儀器廠(chǎng)有限公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 內標溶液

精密稱(chēng)取茶氨酸，配制濃度為0.404mg/mL的內標溶液。

1.2.1.2 標準品溶液

精確稱(chēng)取Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys等17種氨基酸至10mL容量瓶中，加水定容得到混標儲備液。移取1mL混標儲備液和0.5mL內標溶液于5mL容量瓶，加水定容，得到0.0397、0.0496、0.0218、0.0208、0.0078、0.1017、0.0311、0.0447、0.0277、0.0182、0.0207、0.0061、0.0184、0.0263、0.0170、0.0181、0.0446mg/mL的混合氨基酸標準溶液。

1.2.1.3 衍生化試劑

衍生試劑A：取1.4mL1mol/L的三乙胺溶液至10mL容量瓶，用乙腈定容，搖勻；衍生試劑B：吸取125μLPITC至10mL容量瓶，用乙腈定容至刻度，搖勻。

1.2.2 樣品溶液制備與衍生化

1.2.2.1 樣品溶液與空白溶液制備

準確稱(chēng)取20mg羊肚菌于安瓿瓶中，加6.0mol/L的HCl溶液2mL，吹入氮氣后密封，將其置于（105±5）℃恒溫干燥箱中24h，使氨基酸完全水解。取出冷卻后置80℃水浴揮干，多次加水揮發(fā)鹽酸。加1mL蒸餾水溶解，超聲后得到樣品溶液。將0.5mL的內標溶液和樣品溶液移加至5mL容量瓶，加水定容，得到樣品供試溶液，等待衍生。吸取0.5mL的內標溶液加至5mL容量瓶，加水定容，得空白溶液。

1.2.2.2 氨基酸的衍生化

精密吸取200μL的氨基酸標準溶液（或樣品供試溶液、空白液）于離心管中，加入衍生試劑A、B各100μL，置40℃水浴鍋中反應1h，加入400μL正己烷，振蕩靜置10min。取澄清的下層液，過(guò)0.45μm濾膜，即得待測樣品。

1.2.3 色譜條件

分離柱為依利特HypersilODS2（5μm，250mm×4.6mm）；流動(dòng)相A：0.05mol/L乙酸銨溶液（pH6.5）；流動(dòng)相B：乙腈；梯度洗脫（0min，0.8%B；14min，5%B；16min，6%B；16.1min，4%B；21min，4%B；21.1min，3.5%B；30min，3.5%B；32min，8%B；40min，15%B；40.1min，16.5%B；44min，16.5%B；44.1min，20.8%B；50min，23%B；60min，25%B）；流速為1mL/min；檢測波長(cháng)為254nm；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為5μL；
1.2.4一測多評方法學(xué)考察

1.2.4.1 線(xiàn)性考察

精確吸取0.25、0.5、1、2、4mL的混標儲備液，分別置于5mL容量瓶，再分別加入0.5mL內標溶液，加水定容，搖勻，進(jìn)行衍生化處理，按上述的色譜進(jìn)樣測定。以氨基酸對照品的濃度（mg/mL）為X軸，峰面積為Y軸進(jìn)行線(xiàn)性回歸

1.2.4.2 相對校正因子的計算

平行取混合標準溶液6份，進(jìn)行衍生化處理，按上述的色譜條件測定。以Glu為內參物，根據相對校正因子（RCF，f_km）公式fkm=（C_k×A_m）/（C_m×A_k），計算相對校正因子，式中C_k、C_m為內參物和待測成分的濃度，A_m、A_k為內參物和待測成分的峰面積。

1.2.4.3 精密度試驗

精密吸取混合標準品溶液，進(jìn)行衍生化處理后按上述的色譜條件連續測定6次，記錄17種氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）的峰面積，計算RSD值以評價(jià)儀器的精密度。

相關(guān)鏈接：纈氨酸，異亮氨酸，甲硫氨酸，冰醋酸

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