（4）pH的選擇

為了驗證溶液pH對氨基酸檢測含量的影響，移取相同量的標準儲備液，調節溶液酸堿性配成不同pH(2.0～13.0)的同一理論濃度的標準溶液，進(jìn)行上機檢測。實(shí)驗結果表明，蘇氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸5種組分幾乎不受pH的影響，在酸性和堿性條件下，測定含量均比較穩定；而谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸這6種組分檢測含量受溶液pH的影響較大。

從圖3中可以看出，谷氨酸、絲氨酸受pH影響最大，兩種組分在強酸和強堿性條件下測定含量均出現了大幅增大，說(shuō)明在酸堿性條件下這兩種氨基酸在溶液中離子含量較中性時(shí)出現明顯增大，這與其自身的分子結構、特性及解離常數有直接聯(lián)系；苯丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸4種組分測定含量在酸性和堿性條件下波動(dòng)較大，當pH小于4.0時(shí)，測定含量是中性條件下測定含量的86％～128％，而當pH大于10.0時(shí)，這4種組分測定含量波動(dòng)范圍是98％～127％。這些組分受pH的影響較大，主要是因為氨基酸是兩性電解質(zhì)，在酸性條件下，氨基(-NH2)吸收H+帶正電，在堿性條件下，羧基(-COOH)可以失去H+帶負電，因此在強酸和強堿溶液中氨基酸離子含量不穩定，測定含量也就隨之波動(dòng)。氨基酸所帶的正負電荷數量相等時(shí)，即靜電荷為零的兩性離子狀態(tài)下的pH稱(chēng)為氨基酸的等電點(diǎn)。而所測17種氨基酸的等電點(diǎn)在5.05～9.60之間，此時(shí)溶液中氨基酸離子含量穩定，綜合考慮20種組分物化特性、等電點(diǎn)、解離常數等相關(guān)影響因素，我們選擇pH在5.5～7.0條件下，進(jìn)行定量分析。

2、方法學(xué)考察

（1）線(xiàn)性范圍與檢出限

配置20種氨基酸的混合標準工作液，并進(jìn)行校準曲線(xiàn)擬合。通過(guò)色譜峰信噪比來(lái)計算待測組分的檢出限(S／N=3)，在0.05mg／L～2.50mg／L濃度范圍內，進(jìn)行了6個(gè)不同濃度水平(0.05、0.10、0.20、0.50、1.0、2.50mg／L)標準工作液的檢測和線(xiàn)性擬合。結果(見(jiàn)表2)表明，20種組分線(xiàn)性相關(guān)系數均大于0.995，其中有15種組分相關(guān)系數大于0.999，說(shuō)明在該實(shí)驗條件下，20種組分同時(shí)檢測時(shí)線(xiàn)性相關(guān)性良好。20種組分檢出限在0.00107～0.06427mg／L之間，除了個(gè)別亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸外，其他17種檢出限均小于0.05mg／L。

（2）回收率與精密度

分別選取葡萄、橙汁、芒果汁3種果汁飲料樣品，依次向3個(gè)樣品中添加濃度級別水平分別為0.20mg／L、0.50mg／L、2.00mg/L的混合標準溶液，每個(gè)濃度水平進(jìn)行6次平行測定實(shí)驗，來(lái)驗證不同果汁基質(zhì)測定時(shí)方法的回收率和精密度，根據基質(zhì)濃度、添加濃度和添加后測定濃度計算回收率。表3列出三濃度水平、六次平行測定回收率和RSD數據。
 

從表3中可以看出，在0.20mg／L和0.50mg／L添加濃度水平下，精氨酸、賴(lài)氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸的回收率相對較低，回收率多數在82％～90％之間，但依然滿(mǎn)足食品理化檢驗技術(shù)要求(測定含量小于O.10mg／L，回收率應在60％～120％)。20種組分三濃度水平添加回收率在82.73％～107.39％之間，RSD在1.97％～8.72％范圍內，這說(shuō)明20種氨基酸測定回收率好。從總體上來(lái)看，三種基質(zhì)、六次平行測定回收率數據結果符合食品理化檢測要求，表明方法準確性高、精密度好。

3、實(shí)際樣品分析

隨機抽取5種常見(jiàn)果汁飲料(橙汁、芒果汁、蘋(píng)果汁、葡萄汁、椰子汁)，按照離子色譜儀：ICS5000+；色譜柱：AminoPacPAl0(2×250mm)，保護柱：AminoPacPAl0(2×50mm)；積分安培檢測；工作電極：Gold(au)-AAA；參比電極：pH電極；電位波形：G10d，pH-Ag-AgClRE，舭A；流動(dòng)相：A-NaOH溶液，B-去離子水，C-醋酸鈉溶液；流速：0.25mL／min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：25μL中離子色譜條件和準確取果汁待檢樣品0.100g，加入去離子水約150min，搖勻、靜置15min，調節稀釋液pH至5.5～7.0，全部轉移至200mL容量瓶中，采用去離子水定容至刻度，搖勻、靜置15min，取10.0mL溶液，先過(guò)0.229m水相濾膜，再過(guò)已預活化的RP柱，棄去前3mL，收集清液，待上機檢測，進(jìn)行了實(shí)際樣品中氨基酸含量的檢測分析，圖4是實(shí)際樣品測定離子色譜圖。

從5種果汁色譜圖對比來(lái)看，橙汁和葡萄汁中氨基酸的種類(lèi)最多，共檢出15種氨基酸，其次是蘋(píng)果汁，檢出14種氨基酸，而芒果汁、椰子汁中檢出氨基酸僅有7種和6種；從氨基酸含量來(lái)看，檢出含量較大的依次是丙氨酸、甘氨酸、精氨酸，這三種氨基酸也是果汁中主要的氨基酸。因此，建議在日常生活中多飲用橙汁、葡萄汁、蘋(píng)果汁，以確保身體攝取足量的氨基酸。

三、結論

本文采用多級梯度淋洗(MGE)和積分脈沖安培檢測(IPAD)相結合的方法，通過(guò)對流速、柱溫、溶液pH、初始梯度濃度等多種實(shí)驗影響因素的分析討論，探索出適合20種氨基酸分離的梯度淋洗條件，建立了梯度淋洗-積分安培檢測-離子色譜同時(shí)測定果汁中20種氨基酸的分析方法。實(shí)驗證實(shí)，流速為0.25mL／min，柱溫為30℃時(shí)，pH在5.5～7.0之間，20種組分的測定結果穩定、準確。檢測方法高效快捷、靈敏準確、綠色環(huán)保，可以為果汁質(zhì)量控制和營(yíng)養學(xué)判定，提供一種快速定性定量方法。

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