氨基酸是含有氨基和羧基的一類(lèi)有機化合物的統稱(chēng)，是人體內許多重要生化反應的參與者，是生命延續所必須的成分。從營(yíng)養學(xué)角度看，如果缺乏某種必需氨基酸，會(huì )導致生理功能異常，影響正常的抗體代謝，導致疾病產(chǎn)生。果汁是人們生活中常見(jiàn)的飲品，果汁中富含人體所需的有機酸、氨基酸等營(yíng)養物質(zhì)，也是人們攝取氨基酸的重要途徑之一。因此，研究并建立果汁中多種氨基酸含量的檢測方法，具有重要的實(shí)用價(jià)值和現實(shí)意義。

目前，氨基酸分析方法主要有高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細管電泳、氨基酸分析儀法、離子色譜法等，對比分析這些方法，發(fā)現它們各有弊端，液相色譜法和氨基酸分析儀法，需要進(jìn)行柱前或柱后衍生化處理，整個(gè)實(shí)驗過(guò)程比較繁瑣，實(shí)驗誤差比較大，而毛細管電泳和氣相色譜法，對分析儀器或前處理條件要求比較高。

離子色譜法具有快速、準確、靈敏度高、多組分同時(shí)分析等顯著(zhù)的技術(shù)優(yōu)勢，本文采用脈沖安培一離子色譜法，在多級梯度淋洗條件下，通過(guò)研究多種實(shí)驗影響因素，優(yōu)化實(shí)驗測定條件，建立了果汁中20種氨基酸同時(shí)測定的方法，該方法簡(jiǎn)便快捷、選擇性好、靈敏度高，實(shí)現了快速分析、綠色分析、多組分同時(shí)分析的目標。

一、實(shí)驗部分

1、儀器和試劑

離子色譜儀(美國ThermoFisher公司，ICS5000+)，配備電化學(xué)檢測器和自動(dòng)進(jìn)樣器(AS-AP)；高速離心機(德國Hettich公司Rotina380R)；超純水儀(美國Millipore公司，Milli-Q)；電子天平(梅特勒公司ML802／02)；20種氨基酸標準品(＞98.0％，上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；氫氧化鈉溶液(50％w／w，FisherChemical)；醋酸鈉(＞99.9％，ThermoScientific)；鹽酸(優(yōu)級純)。

2、離子色譜條件

離子色譜儀：ICS5000+；色譜柱：AminoPacPAl0(2×250mm)，保護柱：AminoPacPAl0(2×50mm)；積分安培檢測；工作電極：Gold(au)-AAA；參比電極：pH電極；電位波形：G10d，pH-Ag-AgClRE，舭A；流動(dòng)相：A-NaOH溶液，B-去離子水，C-醋酸鈉溶液；流速：0.25mL／min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：25μL。

3、前處理方法

準確取果汁待檢樣品0.100g，加入去離子水約150mE，搖勻、靜置15min，調節稀釋液pH至5.5～7.0，全部轉移至200mL容量瓶中，采用去離子水定容至刻度，搖勻、靜置15min，取10.0mL溶液，先過(guò)0.22μm水相濾膜，再過(guò)已預活化的RP柱，棄去前3mL，收集清液，待上機檢測。

二、結果與討論

1、試驗條件的選擇

（1）流速的選擇

依次考察了0.20、0.25、0.275、0.30mL／min四個(gè)流速條件下的組分分離狀況。結果表明，0.20mL／min時(shí)系統壓力較小，峰寬較大，峰靈敏度下降，整體分離度不高；0.30mL／min時(shí)系統初始壓力高達19.2MPa，35min時(shí)系統壓力超過(guò)上限20.7MPa；O.25和0.275mL／min流速時(shí)，26種組分靈敏度和分離度均很理想，但0.275mL/min時(shí)最高壓力為19.6MPa，接近系統壓力上限，壓力過(guò)大易導致色譜柱塌陷或者系統漏液，影響整個(gè)檢測系統運行的（2）梯度淋洗條件的選擇一般淋洗梯度條件難以實(shí)現20種氨基酸組分的有效分離，為提高檢測靈敏度和色譜峰分離度，先后根據不同淋洗時(shí)間段、不同淋洗濃度、不同淋洗斜率進(jìn)行了30多次實(shí)驗研究分析，最終根據分離效果和基線(xiàn)穩定性選取了表1中多級梯度淋洗條件。從表1中可以看出，色譜分離淋洗時(shí)間被分成5段(0～12min、12～16min、16～24min、24～40min、40～50min)，初始淋洗濃度是整個(gè)多級梯度淋洗條件的基礎，因此在0～12min采用的是50mmol／L氫氧化鈉淋洗液，恰好能夠實(shí)現前10種弱保留組分有效分離。在12～16min時(shí)間段，選擇斜率為7.00mmol／(L·min)濃度氫氧化鈉淋洗液梯度，可確保組分11至組分13有效分離；在16～24min時(shí)間段，開(kāi)始使用較強淋洗溶液醋酸鈉溶液，為中強保留組分洗脫和分離做好準備。在24～40min時(shí)間段，選取氫氧化鈉溶液、醋酸鈉溶液、去離子水配比(24:40:36)的梯度淋洗溶液進(jìn)行洗脫，確保了組分14～19的有效分離。在40～50min時(shí)間段中，為使強保留組分色氨酸快速洗脫，選擇了氫氧化鈉溶液、醋酸鈉溶液配比(50：50)濃度的洗脫液，圖1是20種氨基酸混合標準溶液離子色譜圖。

Peaks：1.精氨酸(Arginine)；2.賴(lài)氨酸(Lysine)；3.谷氨酰胺(Glutamine)；4.天冬酰胺(Asparagine)；5.丙氨酸(Alanine)；6.蘇氨酸(Threonine)；7.甘氨酸(Glycine)；8.纈氨酸(Valine)；9.絲氨酸(Serine)；10.脯氨酸(Proline)l11.異亮氨酸(Isoleucine)；12.亮氨酸(Leucine)；13.蛋氨酸(Methionine)I14.組氨酸(Histidine)；15.苯丙氨酸(Phenylalanine)；16.谷氨酸(Glutamicacid)；17.天冬氨酸(Asparticacid)；18.半胱氨酸(Cysteine)；19.酪氨酸(Tyrosine)；20.色氨酸(Tryptophan)。

（3）柱溫的選擇

溫度能夠影響到色譜柱的柱效、選擇性、檢測靈敏度和穩定性。柱溫改變，直接影響分離效果和分析速率。柱溫升高，會(huì )在一定程度上提高色譜柱內離子交換速率，有利于提高柱效，縮短分析時(shí)間，但降低了分離選擇性，不利于組分之間的分離。從提高分析速率角度考慮，一般會(huì )選擇較高的柱溫，而從提高分離度角度考慮，應該選用較低的柱溫。本文先后考察了25℃、30℃、35℃色譜柱溫條件下多種氨基酸分離狀況。從圖2中可以看出，25℃時(shí)，色譜柱溫較低，系統壓力較大，組分9絲氨酸和組分10脯氨酸，重疊在一起(圖中標記為9號)，沒(méi)有實(shí)現分離。當色譜柱溫為35℃時(shí)，柱溫升高，離子交換速率增大，柱效得到提高，系統壓力降低至14.2MPa，縮短了分析時(shí)間，但降低了柱選擇性，特別是組分13亮氨酸和組分14蛋氨酸的分離度明顯減小，無(wú)法確保定量準確性。在30℃柱溫條件下，系統壓力是15.5MPa，壓力大小適中，分析速率適宜，分離度滿(mǎn)足檢測要求，氨基酸組分的總體分離效果較好，因此，我們選擇在30℃條件下進(jìn)行實(shí)驗分析。
 

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