2.2 EGCG穩定性的改變對NCM460細胞的胞內、外H₂0₂濃度影響

2.2.1 細胞內H₂0₂水平的檢測

對比不同處理時(shí)間點(diǎn)發(fā)現，胞內H₂0₂濃度呈現先上升后下降的趨勢；與對照組0μmol/L相比，H₂0₂濃度lh內出現了短暫增高，其中80μmol/L組極顯著(zhù)增高(P＜0.001)(圖6a)，處理3h后，與對照組相比高濃度EGCG中的H₂0₂濃度出現顯著(zhù)下降(P＜0.05)(圖6c)，這種現象在處理12h后更顯著(zhù)(P＜0.001)(圖6d)。

2.2.2 胞外H₂0₂水平的檢測

結果顯示，隨著(zhù)處理時(shí)間的延長(cháng)，培養體系中H₂0₂濃度呈現上升趨勢；對比相同時(shí)間不同濃度組發(fā)現，處理2、3、6、12h后，20、40、80μmol/L的處理體系H₂0₂濃度顯著(zhù)高于對照組(P＜0.05)，即培養體系巾的H₂0₂濃度隨時(shí)問(wèn)延長(cháng)和EGCG濃度的增加而顯著(zhù)上升，處理24h后胞外的H₂0₂水平出現明顯降低，見(jiàn)圖7。

3 討論

EGCG的多種生物活性已在細胞培養模型中得到證實(shí)，其中最顯著(zhù)的為抗氧化、抗炎和抗癌作用，這表明EGCG很可能成為因ROS增加和/或細胞抗氧化能力不足引發(fā)的退行性疾病的臨床藥物。然而，EGCG在相應動(dòng)物實(shí)驗中的結果是存在爭議的。依據EGCG結構特征，其在細胞培養物中和整個(gè)生物體中的活性不一致可能歸因于EGCG分子的穩定性不足，EGCG不受控的降解或聚合，不僅會(huì )導致體外研究結論不準確，還會(huì )限制EGCG在體內的生物利用度。

本實(shí)驗發(fā)現不同的溶液環(huán)境對EGCG的氧化聚合有較明顯影響，在DMEM培養液中EGCG的聚合效率更高，而H2O的影響較小，這與Krupkova等的研究結果吻合；高溫促進(jìn)了EGCG的自動(dòng)氧化，Krupkova等也證實(shí)低溫可以保持EGCG的穩定性；不同EGCG濃度下EGCG的氧化聚合程度不同，高濃度促進(jìn)EGCG的聚合，同時(shí)，隨著(zhù)反應時(shí)問(wèn)的增長(cháng)，EGCG的聚合物增多；溶液pH對EGCG的穩定性也有較明顯影響，EGCG在酸性環(huán)境中更加穩定(pH＜6)，這與相關(guān)研究相符。由此可見(jiàn)，溶液環(huán)境、溫度、反應時(shí)問(wèn)、EGCG濃度和溶液pH等因素均會(huì )影響EGCG的穩定性，在相關(guān)實(shí)驗條件下應給予考慮。已有研究證實(shí)，環(huán)境是確定EGCG抗淀粉樣蛋白功效的關(guān)鍵因素，因此，解析EGCG穩定性的環(huán)境條件對于進(jìn)一步研究其在機體中發(fā)揮功效的機制有重要意義。

在正常培養細胞體系巾探討了EGCG的穩定性對其抗氧化能力的影響，發(fā)現胞外H₂0₂水平在時(shí)間和濃度效應上與對照組相比呈上升趨勢，而胞內出現先上升后下降的趨勢。研究分析，EGCG在培養體系中會(huì )發(fā)現氧化聚合反應，生成H₂0₂；隨后，H₂0₂進(jìn)入細胞，使胞內H₂0₂水平迅速上升，給細胞造成氧化脅迫，激活胞內的抗氧化系統應對脅迫，隨著(zhù)抗氧化酶系的積極響應，胞內H₂0₂水平出現短暫上升然后開(kāi)始下降，最終表現為EGCG處理后，細胞內H₂0₂濃度低于未處理細胞，表現為抗氧化效應，特別是20μmol/L組，這一過(guò)程可能是EGCG發(fā)揮生物活性，特別是在抗增殖和癌癥治療中的潛在作用。如20μmol/L的EGCG是其通過(guò)預警響應發(fā)揮抗氧化活性的最適濃度，隨著(zhù)EGCG濃度的升高，氧化聚合反應產(chǎn)生的H₂0₂水平超過(guò)細胞氧化應激范圍，可能對細胞造成氧化損傷，詳細分子機制有待進(jìn)一步驗證。

4 結論

RPMI1640和DMEM培養基較H₂0₂更促進(jìn)EGCG的氧化聚合，低溫低EGCG濃度及酸性條件利于EGCG的穩定，同時(shí)EGCG的氧化聚合隨反應時(shí)間延長(cháng)而加劇。存含有細胞的培養體系中，EGCG也會(huì )發(fā)生自動(dòng)氧化聚合并產(chǎn)生H₂0₂，導致細胞內外的H₂0₂濃度升高，但胞內H₂0₂濃度呈現先上升后下降的趨勢。研究結果提示，一定濃度的EGCG在培養細胞中可能通過(guò)氧化聚合產(chǎn)生H₂0₂，形成氧化脅迫，進(jìn)而激活細胞內抗氧化防御系統，使細胞內H₂0₂濃度隨后降低，表現出抗氧化效應。

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