隨著(zhù)人們生活質(zhì)量的提高和對食品營(yíng)養保健功能認識的加強,我國食用植物油的需求不斷增加,油菜是我國重要的油料和經(jīng)濟作物之一,菜籽油不僅富含人體所必需的氨基酸和脂肪酸,而且能較長(cháng)時(shí)間地儲存,為了更好地滿(mǎn)足廣大人民對優(yōu)質(zhì)食用植物油的需求,菜籽油品質(zhì)改良已成為當前油菜育種領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

菜籽油的主要成分是脂肪酸,油脂的優(yōu)劣由脂肪酸決定,而油脂脂肪酸的好壞則主要取決于其碳氫鏈飽和程度。脂肪酸根據碳氫鏈飽和與不飽和分為3類(lèi):飽和脂肪酸(主要有棕櫚酸、硬脂酸等)、單不飽和脂肪酸(油酸、芥酸等)和多不飽和脂肪酸(亞油酸、亞麻酸等),有研究表明,預防冠心病的指導方針集中在將飲食中的飽和脂肪和反式脂肪轉變?yōu)椴伙柡椭?飽和脂肪酸熔點(diǎn)較高,易凝固在血管壁上,從而導致高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化,且飽和脂肪酸還導致血膽固醇濃度上升,不飽和脂肪酸熔點(diǎn)較低,容易被人體吸收。

本研究以湖南省水稻油菜抗病重點(diǎn)實(shí)驗室前期對高亞麻酸甘藍型油菜(Brassicanapus)近等基因系進(jìn)行的miRNA測序結果為基礎,篩選到的與脂肪酸代謝相關(guān)的bna-miR396及其靶基因乙酰轉移酶基因(Acetyltransferasegene,AT)。研究表明,AT通過(guò)催化乙?；鶊F從乙酰輔酶A(乙酰CoA,AcetylCoA)轉移到其作用底物芳香胺及雜環(huán)胺類(lèi)物質(zhì)上,參與脂肪酸轉化與降解,AT缺失會(huì )推遲植物開(kāi)花時(shí)間并降低育性。利用同源基因克隆,得到AT基因的2個(gè)拷貝,分別構建過(guò)表達載體與干擾載體,轉化擬南芥,分析轉基因擬南芥后代種子脂肪酸組成,探究該基因在脂肪酸合成過(guò)程的功能,以期促進(jìn)甘藍型油菜脂肪合成分子機理研究。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

高亞麻酸甘藍型油菜近等基因系（低亞麻酸株系575，亞麻酸含量為5.1%；高亞麻酸株系574，亞麻酸含量9.8%),野生型擬南芥(WT)由湖南農業(yè)大學(xué)國家油料改良中心提供。大腸桿菌感受態(tài)DH5α,限制性?xún)惹忻?、dNTP、T4DNALigationKit購自北京擎科生物科技有限公司；pMD18-T載體由本實(shí)驗室保存；pCambia1300-35s-N1、pCambia1300-RNAi載體購于上?？殿伾锟萍加邢薰?；本試驗中所用到的引物均由北京擎科合成。

1.2 AT基因克隆

利用數據庫進(jìn)行檢索,發(fā)現AT基因有2個(gè)拷貝,分別在A(yíng)基因組和C基因組,并以此序列(GSBRNA2T00114025001、GSBRNA2T00148464001)進(jìn)行后續引物設計(表1),其中5′端酶切位點(diǎn)前的序列用于重組連接。

采用TransZolUP植物總RNA提取試劑盒(北京全式金)提取低亞麻酸甘藍型油菜株系575自交授粉后20～35d混合種子總RNA,并用TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix反轉錄試劑盒(北京全式金)合成cDNA第一鏈,以此為模板,進(jìn)行PCR擴增,擴增體系包含KOD-FX聚合酶1μL,2×PCRBuffer25μL,dNTP(2.5μmol/L)10μL,正反向引物各0.2μmol/L,cDNA小于500ng,用ddH2O補足至50μL。反應條件為98℃2min預變性；98℃10s,60℃30s,68℃2min,35個(gè)循環(huán)；68℃7min延伸。

經(jīng)PCR純化回收后，與pMD18-T載體相連，轉化到大腸桿菌中，由北京擎科公司進(jìn)行測序。

1.3 生物信息學(xué)分析

用SnapGene3.2.1將克隆到的靶基因序列翻譯成氨基酸，經(jīng)NCBI數據庫BlastP進(jìn)行鑒定后,預測對應蛋白的一級結構,包括氨基酸組成、理化性質(zhì)等；分別登錄PredictProtein、SOPMATMHMM網(wǎng)站進(jìn)行蛋白亞細胞定位預測、結構預測、跨膜螺旋區分析；通過(guò)SWISS-MQPEL構建蛋白三級結構模型。

1.5 過(guò)表達載體與RNAi干擾載體構建

用BamHI和SalI雙酶切pCambia1300-35s-N1載體,膠回收，產(chǎn)物進(jìn)行體外同源重組反應,獲得重組質(zhì)粒。

用XbaI及BamHI雙酶切pCambial300-RNAi載體以及各個(gè)基因的RNAi片段的PCR產(chǎn)物,具體方法參考劉芳等,并進(jìn)行改進(jìn),膠回收后進(jìn)行連接,獲得重組質(zhì)粒。測序檢驗正確后,用PstI和Sal.I雙酶切重組質(zhì)粒及各個(gè)基因的RNAi片段的PCR產(chǎn)物,再次進(jìn)行連接,轉化,獲得最終的RNAi載體。

將構建好的過(guò)表達載體與RNAi干擾載體轉入農桿菌中,以野生型擬南芥為受體,進(jìn)行基因轉化,獲得T₀種子；用潮霉素篩選T₀擬南芥陽(yáng)性苗并種植,之后，用PCR鑒定轉基因苗,收取得到T₁種子。

1.6 脂肪酸成分測定

采用SP-6890型氣相色譜儀、FID檢測器、N3000色譜工作站、毛細管色譜柱DB-23對轉基因擬南芥T₁種子進(jìn)行脂肪酸成分測定,對7個(gè)主要的脂肪酸成分進(jìn)行分析,測定時(shí)取5個(gè)轉基因后代株系,每個(gè)材料檢測約30粒種子。

2 結果與分析

2.1 靶基因與特異干擾片段克隆及檢測結果

以低亞麻酸甘藍型油菜20～35d自交種cDNA為模板,高保真擴增了乙酰轉移酶基因的2個(gè)拷貝,大小均為1350bp。分別對2個(gè)靶基因特異片段進(jìn)行PCR高保真擴增,得到了目的片段長(cháng)度大小的DNA片段。

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 蛋白質(zhì)一級結構預測與分析

以SnapGene3.2.1分別對AT基因翻譯出來(lái)的氨基酸序列,通過(guò)ExPASy-ProtParamtool進(jìn)行理化性質(zhì)分析表明(表3),AT基因的2個(gè)拷貝114與148氨基酸均為449個(gè)，分子量約50.5ku,114編碼的氨基酸偏中性而148編碼的蛋白偏堿性。不穩定系數顯示114與148均為穩定蛋白,且親水性較差，屬于脂溶性蛋白。

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