1.3.5 溶解性的測定

參照Garcia等的方法對蛋白溶解性進(jìn)行測定，將TSG和大豆分離蛋白溶于去離子水中配置成50mg/mL溶液，用2mol/L的HCl和NaOH溶液調節溶液pH值，于室溫下攪拌30min后以4000r/min離心30min，取上清液于280nm波長(cháng)下測定紫外分光光度值。

式中：m₁—上清液蛋白質(zhì)含量，g；m₂—總蛋白質(zhì)的含量，g。

1.3.6 乳化性和乳化穩定性的測定

參照Garcia等的方法對蛋白乳化性和乳化穩定性進(jìn)行測定。將TSG和大豆分離蛋白溶于去離子水中配置成質(zhì)量濃度為10mg/mL的溶液，使用2mol/L的HCl和NaOH對其pH值進(jìn)行調節，加入等體積大豆油，10000r/min高速剪切2min，4000r/min離心15min，測量乳化層體積，液體總體積及30min后乳化層體積。并用如下公式計算乳化性和乳化穩定性。

式中：V₁—乳化層體積，mL；V₂—30min后乳化層體積，mL；V₃—液體總體積，mL。

2 結果與分析

2.1 分子質(zhì)量

采用SDS-PAGE電泳法，以蛋白質(zhì)標準品為對照組，對TSG的分子質(zhì)量進(jìn)行測定，結果如圖1所示。圖中最左側條帶為蛋白質(zhì)標準品，條帶1為上樣質(zhì)量濃度8mg/mL的TSG。由圖可知，TSG主要由11個(gè)亞基條帶組成，分布在10～70ku，屬于低分子質(zhì)量蛋白，其中最主要亞基分布在35.34ku及13.83ku兩處，其表達量顯著(zhù)高于其它分子質(zhì)量的條帶。蛋白質(zhì)的亞基組成及大小能夠影響蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。種子球蛋白普遍包含堿性亞基及酸性亞基，分子質(zhì)量分別在20～27ku及30～39ku內，其中酸性亞基有利于蛋白溶解性的提高，這主要是由于酸性亞基的結構疏松，有利于促進(jìn)蛋白質(zhì)分子的伸展及親水基團的暴露，從而提高蛋白質(zhì)的溶解性。而堿性亞基則有利于蛋白持油性的提高，降低蛋白的起泡能力，這可能與堿性亞基的疏水基團較多有關(guān)。蛋白亞基的大小及酸性亞基和堿性亞基的比例對蛋白溶解性、起泡性、乳化性等功能特性造成一定的影響進(jìn)而影響其在食品工業(yè)中的生產(chǎn)應用，如：蛋白質(zhì)亞基組成及大小的不同會(huì )導致蛋白質(zhì)局部厚度不同，致使網(wǎng)狀結構密度形成差異，蛋白大分子亞基含量的減少，有利于蛋白溶解性、乳化性、乳化穩定性的提高，進(jìn)而影響產(chǎn)品營(yíng)養及加工品質(zhì)。因此，了解蛋白的亞基組成、大小及亞基與蛋白功能特性的關(guān)系可為蛋白的開(kāi)發(fā)應用提供科學(xué)指導。

2.2 巰基的二硫鍵含量

采用DTNB比色法，探究中性條件下TSG中總巰基、游離巰基及二硫鍵含量，結果如表1所示。

巰基是蛋白質(zhì)中最具活性的官能團，可改善蛋白質(zhì)的結構性質(zhì)進(jìn)而致使蛋白質(zhì)功能特性發(fā)生改變，巰基發(fā)生氧化反應產(chǎn)生的二硫鍵是穩定蛋白質(zhì)構象重要的共價(jià)鍵，其可使肽鏈的空間結構更緊密，有助于維持蛋白質(zhì)的三維空間結構，因此，二硫鍵含量高的蛋白質(zhì)其結構更趨于穩定。此外，巰基和二硫鍵具有較高的生物活性，含量高時(shí)能顯著(zhù)改善蛋白的結構及表面疏水性、溶解度、乳化性和起泡性，其中表面疏水性與游離巰基含量呈線(xiàn)性正相關(guān)，這可能是由于隨著(zhù)游離巰基含量的增加，蛋白質(zhì)解折疊及疏水性殘基的暴露，導致蛋白表面疏水性增強所致。二疏鍵則在乳化凝膠形成過(guò)程中對脂肪的穩定起決定作用，由表1可知，TSG中游離巰基含量為（33.97±2.94）μmol/g，二硫鍵含量為（44.08±3.79）μmol/g，TSG中巰基及二硫鍵含量均較高，因此功能性質(zhì)良好，在食品工業(yè)上有極大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

2.3 氨基酸

采用PITC柱前衍生氨基酸分析法對TSG的氨基酸組成及含量進(jìn)行分析，結果如表2所示。由表可知TSG氨基酸種類(lèi)組成較齊全，總氨基酸含量為528.17mg/g，其中必需氨基酸含量占總氨基酸含量（E/T）的45.85%，必需氨基酸/非必需氨基酸（E/N）比值為0.85，均顯著(zhù)高于FAO/WHO理想蛋白質(zhì)標準中人體必需氨基酸含量/氨基酸總含量（40%）及人體必需氨基酸含量/非必需氨基酸（0.6）標準值。在8種必需氨基酸中，異亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸及蘇氨酸含量最為豐富，其中異亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸均高于FAO中推薦值（異亮氨酸含量4.0%，苯丙氨酸含量6.0%、蘇氨酸含量4.0%）。但TSG中缺少含硫氨基酸——蛋氨酸，推測可能是由于酸水解作用導致氨基酸損失所致。此外田琨等研究表明豆科植物中缺乏蛋氨酸，因此蛋氨酸的缺少也可能與TSG提取原料有關(guān)。含硫氨基酸中除蛋氨酸外還包括半胱氨酸和胱氨酸，是蛋白質(zhì)中巰基和二硫鍵的主要來(lái)源，二者可通過(guò)氧化還原而互變。TSG中胱氨酸的含量約占總氨基酸含量的5.89%，而青稞蛋白和大豆分離蛋白中僅為1.51%，1.30%，胱氨酸含量的高低直接影響巰基及二硫鍵的含量，因而致使TSG巰基和二硫鍵含量較高。

2.4 溶解性

以大豆分離蛋白為對照組，對相同質(zhì)量濃度不同pH值條件下大豆分離蛋白和TSG的溶解性進(jìn)行測定，結果如圖2所示。由圖可知，隨著(zhù)pH值的升高，TSG和大豆分離蛋白的溶解性均呈現先升高后降低而后逐漸平穩升高的趨勢。在極端酸性條件pH2.5到等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解性發(fā)生驟降且在等電點(diǎn)附近時(shí)達到最小，其中TSG溶解性從（87.66±4.87）%降低到（12.58±0.97）%，大豆分離蛋白從（94.96±3.97）%降低到（13.07±0.85）%。隨后越偏離等電點(diǎn)，TSG及大豆分離蛋白的溶解度越高，pH值到8.5以后，溶解度趨于穩定上升。由于食品加工過(guò)程中不涉及極端酸堿的處理，因此本文著(zhù)重對pH4.0～10.0范圍內TSG及大豆分離蛋白的溶解性進(jìn)行對比分析，發(fā)現TSG在pH4.0～10.0條件下的溶解性?xún)?yōu)于大豆分離蛋白，在中性條件pH7.0時(shí)TSG溶解性為（76.74±2.76）%，比大豆分離蛋白高26.9%。

蛋白質(zhì)的溶解度能夠顯著(zhù)影響其它功能特性，因此常被作為評價(jià)其加工價(jià)值的重要參數。由于蛋白質(zhì)具有兩親性，因此其溶解度常受到溶液pH值環(huán)境及離子強度的影響。當溶液pH值處于蛋白質(zhì)自身等電點(diǎn)時(shí)，蛋白所帶電荷數最少，與水分子的作用最弱，此時(shí)蛋白質(zhì)分子間的相互作用力增強，更易發(fā)生蛋白質(zhì)聚集，因而溶解度最低；而在小于或高于等電點(diǎn)的pH值范圍時(shí)，蛋白質(zhì)正、負電荷不平衡，蛋白質(zhì)同水分子的結合能力增強，溶解度隨之增加。蛋白質(zhì)的氨基酸種類(lèi)也是影響其親水性/疏水性平衡及溶解度的重要因素，疏水氨基酸如亮氨酸、異亮氨酸等可通過(guò)疏水鍵相互結合在蛋白質(zhì)中心形成疏水區域；親水氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸等則可與水分子形成位于蛋白外側的親水區域?？梢?jiàn)蛋白質(zhì)中親/疏水程度的差異使其呈現出不同的溶解性，TSG的親水性氨基酸含量為54.98%，大豆分離蛋白親水性氨基酸含量為46.70%，這是TSG蛋白溶解性高于大豆分離蛋白的主要原因。

相關(guān)鏈接：氨基酸，異亮氨酸，天冬氨酸，苯丙氨酸

聲明：本文所用圖片、文字來(lái)源《中國食品學(xué)報》，版權歸原作者所有。如涉及作品內容、版權等問(wèn)題，請與本網(wǎng)聯(lián)系