2.4 發(fā)酵處理對豆腐黃漿水中有機酸含量的影響

表4顯示了屎腸球菌R2發(fā)酵豆腐黃漿水過(guò)程中乳酸、醋酸、酒石酸等9種有機酸的變化。結果表明，在新鮮豆腐黃漿水中丁二酸含量最高，檸檬酸含量次之，接下來(lái)為醋酸、酒石酸、蘋(píng)果酸和乳酸，馬來(lái)酸和富馬酸含量很低，草酸含量最低，未檢出。

2.5 發(fā)酵處理對豆腐黃漿水中大豆異黃酮組成和含量的影響

大豆異黃酮是大豆生長(cháng)中形成的一類(lèi)次級代謝產(chǎn)物，具有抗腫瘤、預防心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥、改善婦女更年期綜合征等多種功效。大豆異黃酮共有12種異構體，以游離型黃酮苷元（Aglycones）和結合型糖苷（Glycosides）2種形式存在。苷元型大豆異黃酮主要包括染料木素（Genistein）、黃豆黃素（Glycitein）和大豆苷元（Daidzein）；糖苷型大豆異黃酮主要包括染料木苷（Genistin）、大豆黃素苷（Glycitin）、大豆苷（Daidzin）以及它們各自的乙?；咸烟擒蘸捅Ｆ咸烟擒昭苌?。

天然存在的大豆異黃酮主要以結合型β-葡萄糖苷的形式存在，這種形式的大豆異黃酮較難被人體吸收；游離苷元型大豆異黃酮不僅具有更高的生物活性，而且更容易被腸道吸收。

研究了屎腸球菌R2的發(fā)酵作用對豆腐黃漿水中染料木苷、大豆黃素苷、大豆苷、染料木素、大豆苷元及黃豆黃素含量的影響，結果如圖4所示。在新鮮豆腐黃漿水中大豆異黃酮總量為245.17mg/L，其中糖苷型大豆異黃酮含量為175.12mg/L，這與賀云的結果一致，即大部分大豆異黃酮以結合型糖苷的形式存在。

新鮮豆腐黃漿水經(jīng)過(guò)屎腸球菌R2的發(fā)酵作用后，其大豆異黃酮組分的存在形式及含量都發(fā)生了變化。結果表明，隨著(zhù)發(fā)酵時(shí)間的延長(cháng)，糖苷型大豆異黃酮含量逐漸降低，苷元型大豆異黃酮含量明顯升高，這表明屎腸球菌R2能夠促進(jìn)糖苷型大豆異黃酮向苷元型大豆異黃酮轉化。發(fā)酵36h后，低活性糖苷型異黃酮含量顯著(zhù)減少（P＜0.05），其含量下降到23.40mg/L；其中大豆苷和染料木苷在發(fā)酵24h后含量為零，全部轉化，而大豆黃素苷的含量變化相對較??；同時(shí)，游離型苷元異黃酮的含量顯著(zhù)增加（P＜0.05），由70.05mg/L增加到115.21mg/L；其中大豆苷元含量由25.43mg/L增加至43.17mg/L，染料木素含量由24.90mg/L增加至50.16mg/L，黃豆黃素含量由19.72mg/L增加至21.88mg/L。

發(fā)酵24h后染料木苷和大豆苷已被完全轉化，但是24h后染料木素和大豆苷元的含量仍在增加（P＜0.05），說(shuō)明還存在丙二酰染料木苷和丙二酰大豆苷，當原有的染料木苷和大豆苷消耗完以后，這兩種丙二酰葡萄糖苷轉化成相應的β-葡萄糖苷后又繼續向苷元型異黃酮轉化。另外，經(jīng)過(guò)屎腸球菌R2的發(fā)酵作用，大豆異黃酮總量由245.17mg/L下降到138.60mg/L，可能是因為大豆苷轉化成大豆苷元后，在屎腸球菌R2的作用下又進(jìn)一步轉化成雌馬酚。雌馬酚是大豆異黃酮重要的代謝終產(chǎn)物，由大豆苷元在腸道菌的作用下經(jīng)特異性代謝得到，具有較異黃酮前體更高的生物活性，且性質(zhì)穩定，容易被人體吸收。姜雪從女性體內篩選出1株可以轉化大豆苷元生成雌馬酚的腸道菌屎腸球菌HY-1。因此，屎腸球菌R2很可能也具有將大豆苷元轉化成雌馬酚的能力。

2.6 屎腸球菌R2β-葡萄糖苷酶的定位及活性分析

研究表明乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中可促進(jìn)豆腐黃漿中糖苷型大豆異黃酮向游離苷元型大豆異黃酮轉化，這主要是β-葡萄糖苷酶的酶解作用。對屎腸球菌R2發(fā)酵過(guò)程中不同部位的β-葡萄糖苷酶酶活進(jìn)行測定，結果如圖5所示，可知屎腸球菌R2具有β-葡萄糖苷酶酶活，且不同部位的酶活具有顯著(zhù)差異（P＜0.05）。菌體上清中的β-葡萄糖苷酶酶活幾乎為零，破碎沉淀酶活顯著(zhù)高于破碎上清酶活，說(shuō)明屎腸球菌R2的β-葡萄糖苷酶屬于胞內酶，且主要以不可溶性蛋白形式為主。這一結果與張哲的研究一致，其研究發(fā)現植物乳桿菌的β-葡萄糖苷酶為胞內酶，主要為處于細胞膜上的不可溶性酶，還有少量存在于原生質(zhì)體內細胞液中的可溶性酶。由圖5可以看出，隨著(zhù)發(fā)酵時(shí)間的延長(cháng)，β-葡萄糖苷酶的酶活先增加后稍有下降，在發(fā)酵24h時(shí)達到最大。

2.7 發(fā)酵處理對豆腐黃漿水清除DPPH自由基能力的影響

大豆異黃酮具有很強的抗氧化活性，經(jīng)過(guò)乳酸菌的發(fā)酵作用，糖苷型大豆異黃酮轉化為苷元型大豆異黃酮，抗氧化活性會(huì )進(jìn)一步增強。圖6為發(fā)酵黃漿水DPPH自由基的清除能力，由圖6可以看出，屎腸球菌R2發(fā)酵豆腐黃漿可顯著(zhù)提高其清除DPPH自由基的能力，發(fā)酵36h后，黃漿水DPPH自由基的清除能力由14.20μgＴrolox/mL增加到55.25μgＴrolox/mL。

使用Pearson相關(guān)性檢驗對大豆異黃酮轉化與DPPH自由基清除能力進(jìn)行相關(guān)性分析，結果如表5所示。結果顯示，游離型苷元大豆異黃酮大豆苷元和染料木素的含量與DPPH自由基清除能力呈顯著(zhù)正相關(guān)（P＜0.05），并且染料木素的含量與DPPH自由基清除能力呈極顯著(zhù)正相關(guān)（P＜0.01），同時(shí)，糖苷型大豆異黃酮大豆苷和染料木苷的含量與DPPH自由基清除能力呈顯著(zhù)負相關(guān)（P＜0.05），而大豆黃素苷和黃豆黃素與DPPH自由基清除能力之間不相關(guān)（P＜0.05）。說(shuō)明屎腸球菌R2發(fā)酵過(guò)程中DPPH自由基清除能力的提高確實(shí)與大豆異黃酮的生物轉化有關(guān)，且主要因為染料木素和大豆苷元含量的增加。

3 結論

對屎腸球菌R2發(fā)酵作用對豆腐黃漿水中低聚糖、有機酸和大豆低聚糖含量以及DPPH清除能力的影響進(jìn)行了研究。結果表明，屎腸球菌R2可以產(chǎn)生α-半乳糖苷酶以利用豆腐黃漿水中的碳水化合物生長(cháng)產(chǎn)酸，可以有效地降解棉籽糖和水蘇糖，產(chǎn)生大量的乳酸、醋酸等有機酸，最終使pH下降到3.6以下；同時(shí)，屎腸球菌R2還可以產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶將活性低的糖苷型大豆異黃酮（主要為大豆苷和染料木苷）轉化為高活性游離型苷元大豆異黃酮，進(jìn)而顯著(zhù)提高了黃漿水清除DPPH自由基的能力。對α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶進(jìn)行了初步定位，結果表明兩種酶均屬于胞內酶，且主要為不可溶性蛋白酶，但是兩種酶的確切位置及酶活特性還需進(jìn)一步研究；另外，經(jīng)過(guò)屎腸球菌R2的發(fā)酵作用，所測的大豆異黃酮總量有所下降，因此，在發(fā)酵的過(guò)程中大豆苷元很可能繼續轉化為大豆異黃酮代謝終產(chǎn)物雌馬酚，其具體的代謝機理仍需進(jìn)一步探討。

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