（2）綠豆多肽抗氧化性與酶濃度的關(guān)系

參照于慧等人的方法進(jìn)行DPPH自由基清除率的測定。將2mL一定濃度的綠豆多肽溶液和2mL的0.12mm01·L^-1DPPH溶液進(jìn)行混合，避光于25℃條件下反應30min，取出后于517nm波長(cháng)下進(jìn)行吸光值的測定，此時(shí)吸光度值記錄為A_i；將上述過(guò)程中的2mLDPPH溶液用無(wú)水乙醇取代，然后與2mL綠豆多肽溶液進(jìn)行反應，此條件下測定吸光值記錄為A_j，將2mL無(wú)水乙醇與2mLDPPH溶液反應的條件作為空白組，此時(shí)記錄吸光值為Ao。結果如圖2所示。

由圖2可知，當酶濃度低于6％時(shí)，DPPH清除率隨著(zhù)酶濃度的增加而增大，當酶濃度超過(guò)6％時(shí)，DPPH清除率隨著(zhù)酶濃度的升高而降低。整體呈現先上升后下降的原因在于隨著(zhù)酶濃度的升高，有效酶濃度逐漸加大。當底物的濃度維持不變，有效酶濃度逐漸增多，從而起到抑制作用，使酶水解的不徹底，故水解得到的抗氧化肽減少，進(jìn)而導致DPPH清除率降低。

（3）綠豆多肽抗氧化性與pH的關(guān)系

本實(shí)驗在于研究酶法對綠豆蛋白水解的抗氧化肽的工藝優(yōu)化，故以DPPH為指標，選擇酶解時(shí)間、酶解溫度、酶添加量以及pH為因素進(jìn)行單因素實(shí)驗。改變反應pH，結果見(jiàn)3所示。
 

由上圖可知，當pH在7.0～9.0時(shí)，DPPH的清除率隨著(zhù)pH的增大逐漸增大，當pH為9.00時(shí)，DPPH清除率達到最大值，為43.89％。當pH超過(guò)9.0時(shí)，DPPH清除率逐漸減小。這是因為蛋白酶只有在一定的pH區間內具有較高的活性，當蛋白酶處于過(guò)酸或過(guò)堿的條件下時(shí)蛋白酶的結構會(huì )被破壞，導致部分蛋白無(wú)法完全水解，疏水基團未完全暴露，使得生成肽的抗氧化涪陛降低。

（4）綠豆多肽抗氧化性與酶解時(shí)間的關(guān)系

通過(guò)單因素實(shí)驗的結果，可以篩選出各因素的三個(gè)水平。所以在此基礎之上，應用統計分析軟件建立4因素3水平的Box—Behnken模型，進(jìn)行回應面優(yōu)化設計。改變酶解時(shí)間結果見(jiàn)4所示。

二、結果與討論

1、單因素實(shí)驗結果

（1）綠豆多肽抗氧化性與酶解溫度的關(guān)系

將綠豆蛋白配置成一定濃度的溶液，水浴加熱至100℃進(jìn)行15min均質(zhì)處理。待溶液冷卻至酶解最適溫度，水浴保溫，向溶液中加入0.5mol／L的NaOH調節其pH，酶解一段時(shí)間后100℃水浴滅活10min，室溫下離心(4000r／min，20min)，將上清液凍干后保存。結果如圖l所示。

由圖1可知，當酶解溫度低于50℃，DPPH清除率與溫度成正比，當溫度超過(guò)50℃時(shí)，DPPH清除率開(kāi)始下降。這是因為蛋白酶對穩定的要求較高，溫度過(guò)低會(huì )影響酶解的反應速度，使酶解反應不徹底，從而影響抗氧化肽的抗氧化效果。而溫度過(guò)高則會(huì )影響蛋白酶的活性，使蛋白酶的活性降低，無(wú)法使蛋白水解成具有抗氧化性的小分子肽段，從而使DPPH清除率降低。

（2）綠豆多肽抗氧化性與酶濃度的關(guān)系

將2mL一定濃度的綠豆多肽溶液和2mL的0.12mm01·L^-1DPPH溶液進(jìn)行混合，避光于25℃條件下反應30min，取出后于517nm波長(cháng)下進(jìn)行吸光值的測定，此時(shí)吸光度值記錄為A_i；將上述過(guò)程中的2mLDPPH溶液用無(wú)水乙醇取代，然后與2mL綠豆多肽溶液進(jìn)行反應，此條件下測定吸光值記錄為A_j，將2mL無(wú)水乙醇與2mLDPPH溶液反應的條件作為空白組，此時(shí)記錄吸光值為Ao。結果如圖2所示。

由圖2可知，當酶濃度低于6％時(shí)，DPPH清除率隨著(zhù)酶濃度的增加而增大，當酶濃度超過(guò)6％時(shí)，DPPH清除率隨著(zhù)酶濃度的升高而降低。整體呈現先上升后下降的原因在于隨著(zhù)酶濃度的升高，有效酶濃度逐漸加大。當底物的濃度維持不變，有效酶濃度逐漸增多，從而起到抑制作用，使酶水解的不徹底，故水解得到的抗氧化肽減少，進(jìn)而導致DPPH清除率降低。

（3）綠豆多肽抗氧化性與pH的關(guān)系

本實(shí)驗在于研究酶法對綠豆蛋白水解的抗氧化肽的工藝優(yōu)化，故以DPPH為指標，選擇酶解時(shí)間、酶解溫度、酶添加量以及pH為因素進(jìn)行單因素實(shí)驗。

實(shí)驗條件進(jìn)行實(shí)驗，改變反應pH，結果見(jiàn)3所示。

由上圖可知，當pH在7.0～9.0時(shí)，DPPH的清除率隨著(zhù)pH的增大逐漸增大，當pH為9.00時(shí)，DPPH清除率達到最大值，為43.89％。當pH超過(guò)9.0時(shí)，DPPH清除率逐漸減小。這是因為蛋白酶只有在一定的pH區間內具有較高的活性，當蛋白酶處于過(guò)酸或過(guò)堿的條件下時(shí)蛋白酶的結構會(huì )被破壞，導致部分蛋白無(wú)法完全水解，疏水基團未完全暴露，使得生成肽的抗氧化涪陛降低。

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