（4）綠豆多肽抗氧化性與酶解時(shí)間的關(guān)系

通過(guò)單因素實(shí)驗的結果，可以篩選出各因素的三個(gè)水平。所以在此基礎之上，應用統計分析軟件建立4因素3水平的Box—Behnken模型，進(jìn)行回應面優(yōu)化設計實(shí)驗條件進(jìn)行實(shí)驗，改變酶解時(shí)間結果見(jiàn)4所示。

由圖4可知，當反應時(shí)間不超過(guò)2h，DPPH清除率與溫度成正比，當反應時(shí)間超過(guò)2h，DPPH清除率與溫度成反比，在2h時(shí)DPPH清除率達到峰值。當水解的時(shí)間過(guò)短時(shí)，綠豆蛋白大分子沒(méi)有水解成具有小分子生物活性的生物活性肽，因而水解物DPPH的清除率較小。而水解的時(shí)間過(guò)長(cháng)則會(huì )導致大分子蛋白質(zhì)過(guò)度水解成氨基酸或者是已不具備生物活性短肽鏈的物質(zhì)。

2、應面實(shí)驗結果

（1）回歸方程模型方差分析

單因素實(shí)驗討論了各個(gè)因素對綠豆多肽抗氧化性的影響，為了全面考察影響因素，仍需確定酶解時(shí)間、酶解溫度、pH、酶濃度對綠豆抗氧化肽的抗氧化性的影響。故采用繼續用響應法對綠豆抗氧化肽提取的工藝進(jìn)行優(yōu)化。以酶解溫度(X₁)、酶解pH(X₂)、酶濃度(X₃)、酶解時(shí)間(X₄)為自變量，DPPH清除率的響應面實(shí)驗結果見(jiàn)表2。溫度(X₁)、酶解pH(X₂)與酶濃度(X₃)、酶解時(shí)間(X₄)為自變量，DPPH清除率為回應值的響應面實(shí)驗結果見(jiàn)表2。

根據響應面實(shí)驗設計及其實(shí)驗結果，需要建立回歸方程模型，用于判斷各因素之間的交互作用是否顯著(zhù)，為用于研究和分析綠豆多肽抗氧化性的變化，故而還需判斷其誤差的大小。即實(shí)驗擬合度與在最佳條件下抗氧化性的吻合程度。綠豆多肽抗氧化性的回歸方程模型的方差分析如表3所示。

由表3可知，該回歸模型P＜O.000l，方程模型達到極顯著(zhù)，失擬項P=0.1471＞0.05，不顯著(zhù)，說(shuō)明模型建立正確。該回歸模型的總決定系R²=0.9568，說(shuō)明方程擬合度較好，實(shí)驗誤差小，故該回歸方程模型成立，可以用此模型對綠豆多肽的抗氧化性進(jìn)行分析及預測。由此模型得到的此回歸方程為：Y=45.24—6.00X₁+1.47X₂—1.35X₃+0.36X₄+1.81X₁X₂—2.60X₁X₃+1.06X₁X₄+0.20X₂X₃一0.17X₂X₄+0.14X₃X₄—4.98X₁²—0.97X₂²—0.70X₃²—0.90X₄²。

（2）響應曲面結果分析

響應面圖可反映出各個(gè)因素對綠豆多肽抗氧化性的影響，根據曲面圖的開(kāi)口朝向及曲面形狀判斷在實(shí)驗范圍內是否存在最值、各因素之間的相互作用是否顯著(zhù)。

結合表3、圖5及圖6可看出，影響DPPH自由基清除率的先后順序為：溫度(X₁)＞pH(X₂)＞酶濃度(X₃)>酶解時(shí)間(X₄)，X₁、X₂、X₃、X_1³項達到互極顯著(zhù)水平(P＜0.01)，X_1²、項達到顯著(zhù)水平(P＜0.05)。響應面的最優(yōu)條件：溫度43.47℃，pH為9.19，酶濃度為6.51％，水解時(shí)間為2.22h，DPPH自由基清除率47.14％。

3、驗證實(shí)驗

為了驗證響應面結果的可靠性，根據響應面優(yōu)化出的最佳工藝進(jìn)行三次驗證實(shí)驗。實(shí)際得到的綠豆多肽DPPH清除率的平均值是47.03％，與分析值相差0.23％。與響應面預測值較為吻合，說(shuō)明響應面得出的最優(yōu)條件具有可行性。

三、結論

通過(guò)響應面優(yōu)化實(shí)驗分析出影響綠豆抗氧化肽的制備因素，這四個(gè)因素對綠豆抗氧化肽提取的影響程度順序為：酶解溫度＞pH＞酶濃度＞酶解時(shí)間。本實(shí)驗得出的綠豆抗氧化工藝條件為：酶解溫度43.47℃、pH9.19、酶濃度6.51％、酶解時(shí)間2.22h，在此工藝條件下得到的綠豆抗氧化肽對DPPH清除率的平均值為47.03％，與軟件給出的理論值相差0.23％。本實(shí)驗對綠豆抗氧化肽提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，且綠豆多肽的抗氧化性為綠豆多肽在抗氧化食品、保健品等方面的開(kāi)發(fā)及藥理學(xué)研究提供了更為有效的依據。

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