2.2.2堿溶液濃度和水解時(shí)間的選擇

以NIST 1849a配方乳粉質(zhì)控樣作為研究對象，使用2、3和4 mol/L 3種濃度的LiOH溶液分別水解18、20和22 h，測定的色氨酸含量如圖4所示。由圖中數據可知，2和3 mol/L堿溶液經(jīng)22 h仍沒(méi)有水解完全，而4 mol/L的LiOH在18 h已經(jīng)水解完全，繼續水解20和22 h沒(méi)有明顯變化，為了保證充分的水解，以準確測定總色氨酸的含量，選擇4 mol/L LiOH水解溶液、水解時(shí)間20 h作為最佳的水解條件

2.2.3水解溫度的確定

為考察水解溫度的影響，設計了100、110、120 ℃ 3個(gè)水解溫度進(jìn)行考察，結果見(jiàn)圖5。由圖中數據可見(jiàn)，110和120 ℃水解結果在18和20 h的時(shí)候無(wú)顯著(zhù)差異，但120 ℃在22 h以后出現了明顯的下降；而在100 ℃條件下，樣品水解至22 h依然未能水解完全，且增加反應時(shí)間后，色氨酸濃度反而出現了下降，通過(guò)色氨酸標準品的堿水解實(shí)驗驗證，發(fā)現水解時(shí)間過(guò)長(cháng)，游離色氨酸會(huì )部分被破壞，故本方法選擇110 ℃作為水解溫度。

2.2.4堿水解法內標確定

由于堿水解過(guò)程溫度高，時(shí)間長(cháng)，對不同的樣品進(jìn)行加標回收試驗發(fā)現色氨酸長(cháng)時(shí)間在高溫高濃度的堿中會(huì )有一定程度的損失，而且不同基質(zhì)中色氨酸的損失不同。試驗增加了在堿水解過(guò)程中充氮保護的措施，結果表明色氨酸的損失在充入氮氣保護后略有改善，但使用充氮保護下堿水解的方法測試質(zhì)控樣NIST1849a，結果僅為168 mg/100 g，不能達到滿(mǎn)意的結果；參考標準GB/T 15400—2018 《飼料中色氨酸的測定》在水解前對樣品進(jìn)行除脂，試驗結果表明除脂僅對水解液的外觀(guān)有所改變，對測定結果沒(méi)有改善。因此在優(yōu)化前處理方法無(wú)法有效降低色氨酸損失的前提下，采用色氨酸的結構類(lèi)似物作為內標進(jìn)行同步校正，提高定量準確性的同時(shí)簡(jiǎn)化樣品處理步驟。本方法將5-甲基-色氨酸和α-甲基-色氨酸作為研究對象來(lái)考察其作為內標物定量堿水解方法測定色氨酸含量的可行性。

先后選擇了NIST質(zhì)控樣1849a和1869作為研究對象，分別加入5-甲基-色氨酸和α-甲基-色氨酸內標后，進(jìn)行堿水解。表2不同定量方式和不同內標的定量結果顯示，相同條件下以α-甲基-色氨酸作為內標得到的2個(gè)質(zhì)控樣的含量均能滿(mǎn)足明示的范圍，而5-甲基-色氨酸作為內標得到的結果偏高，外標法定量的結果則達不到質(zhì)控樣的明示下限。以α-甲基-色氨酸作為內標來(lái)定量能得到更為準確的結果。

2.3方法學(xué)驗證

2.3.1線(xiàn)性范圍和定量限

準確吸取色氨酸標準溶液（100 μg/mL）20、100和500 µL、1.0、2.0和5.0 mL于10 mL容量瓶中，加入100 µL內標（1 mg/mL）工作液，用水定容至刻度，混勻后得到濃度分別為0.2、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的標準工作溶液，分別將標準系列工作液按照濃度由低到高的順序注入液相色譜儀中，測得相應色譜峰的峰面積，以系列混合標準工作液的濃度為橫坐標，以目標化合物的峰面積與內標的峰面積的比值為縱坐標，繪制標準曲線(xiàn)。相關(guān)系數r＞0.999，覆蓋方法定量限和常見(jiàn)樣品的含量水平，線(xiàn)性良好。將S/N＞10且能準確定量的最低濃度點(diǎn)計算出的含量確定為方法的定量限。結果見(jiàn)表3。

2.3.2方法準確度和精密度

試驗選取代表性樣品進(jìn)行加標回收試驗，樣品分別為嬰幼兒配方乳粉、乳蛋白部分水解樣品和氨基酸配方樣品，對樣品進(jìn)行平行試驗得出本底值后再對每個(gè)樣品做0.5倍、1倍和2倍本底值水平的加標試驗，以回收率和相對標準偏差（RSD）評價(jià)方法的準確度和精密度。試驗樣品回收率和RSD見(jiàn)表4。樣品的平均回收率在92.5%~97.4%之間，RSD差均小于3.11%。將試驗樣品選取4家機構進(jìn)行驗證，實(shí)驗室間RSD小于6.7%，顯示了良好的準確度和精密度。

2.3.3實(shí)際樣品應用

采用開(kāi)發(fā)的方法對21個(gè)不同種類(lèi)樣品進(jìn)行測定。樣品包括不同品牌嬰幼兒配方乳粉8個(gè)、乳蛋白部分水解配方食品4個(gè)、乳蛋白深度水解配方食品4和氨基酸配方食品5個(gè)。樣品中色氨酸含量范圍為170~315 mg/100 g，回收率92%~98%，均符合GB 10765—2010《食品安全國家標準嬰兒配方食品》中對色氨酸含量的要求。

3.結論

本研究以α-甲基-色氨酸為內標物，采用堿水解-高效液相色譜法測定了乳粉及特殊醫學(xué)用途嬰兒配方食品中的色氨酸。內標法較好的校正了水解過(guò)程中高溫、高濃度堿溶液和不同基質(zhì)在處理過(guò)程中對色氨酸的影響，同時(shí)省略了前處理過(guò)程中充氮氣保護等步驟，對該方法進(jìn)行方法學(xué)驗證，也能得滿(mǎn)意的準確度和精密度。應用于不同種類(lèi)的樣品和質(zhì)控樣中目標物的測定均符合明示值，表明該方法操作簡(jiǎn)單、準確度高，重復性好，適用于乳粉及特殊醫學(xué)用途嬰兒配方食品中色氨酸的準確定性定量，可為企業(yè)生產(chǎn)和有關(guān)部門(mén)監管提供理論支撐。

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