天然的CLA主要存在于動(dòng)物、植物、海產(chǎn)品中，如在牛、羊等反芻類(lèi)動(dòng)物的乳脂和肉制品中含量較高。c9，t11-CLA還被命名為瘤胃酸（ru-menicacid）。自上世紀50年代開(kāi)始，人們接連在反芻動(dòng)物的脂肪組織、烤牛肉中發(fā)現了CLA，并證實(shí)其抗癌功能。發(fā)酵乳是經(jīng)乳酸菌發(fā)酵動(dòng)物乳而制成的，因獨特的滋味和特殊的營(yíng)養價(jià)值而受到人們的喜愛(ài)。對發(fā)酵乳產(chǎn)品的檢測，包括感官評價(jià)、理化指標、污染物限量、真菌毒素限量、微生物限量、乳酸菌數等。對發(fā)酵乳發(fā)酵性能的檢測包括質(zhì)構、流變、滋味、氣味、持水性等指標。

目前，在原始發(fā)酵乳基礎上加入其它營(yíng)養物質(zhì)，以提高發(fā)酵乳的營(yíng)養特性、風(fēng)味特性和發(fā)酵特性的產(chǎn)品越來(lái)越多。加入益生菌的發(fā)酵乳營(yíng)養更加豐富，攝入的益生菌在人體內積累定植后，對改善宿主體內的微生態(tài)平衡具有重要作用，益生菌乳制品同時(shí)還具有緩解乳糖不耐癥，抗高血壓，降低生殖道感染風(fēng)險，促進(jìn)Ca²⁺吸收和維生素生成等功能。許多可生產(chǎn)CLA的菌株均為乳酸菌，可用于發(fā)酵。當使用能生產(chǎn)CLA的菌株生產(chǎn)功能性乳制品時(shí)，便可將CLA較好地融入產(chǎn)品中，從而利于乳制品的多種有益功能。有研究發(fā)現，將產(chǎn)CLA的乳酸乳球菌、植物乳桿菌和干酪乳桿菌復配后發(fā)酵牛奶，所得產(chǎn)物中CLA最大值為56.51mg/mL。目前大多CLA在食品中應用較少，如何能獲得高產(chǎn)CLA的乳酸菌并應用于發(fā)酵乳中，具有較大的意義。本研究從發(fā)酵乳中篩選菌株，得到產(chǎn)共軛亞油酸的菌株，將其直接用于制作發(fā)酵乳，研究該菌株的發(fā)酵性能，測定CLA的產(chǎn)量，評估發(fā)酵乳的綜合指標，以獲得CLA含量高，品質(zhì)好的發(fā)酵乳。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵乳樣品和純牛奶采自?xún)让晒藕艉秃铺睾秃魝愗悹?，采集后置于無(wú)菌容器，放于冰盒中帶回。革蘭氏染色液試劑盒，索萊寶科技有限公司（北京）；細菌DNA提取試劑盒，康為世紀生物科技有限公司（北京）；DL2000DNAMarker、DL15000DNAMarker，大連寶生物；2×EsTaqMasterMix（Dye）、6×SuperStainLoadingBuffer，北京康為世紀；溶菌酶，北京索萊寶；瓊脂糖，北京中科瑞泰生物；亞油酸（LA），90%純度，上海聯(lián)邁生物；共軛亞油酸標準品（CLA），Sigma公司。

1.2 儀器與設備

PCR儀（Eppendorf）、高速冷凍離心機（Ep-pendorf），德國Eppendorf公司；超微量核酸蛋白定量?jì)x（ThermoFisher），ThermoFisher公司；質(zhì)構儀（BROOKFIELD），美國B(niǎo)ROOKFIELD；電子舌（In-sent），日本Insent。

1.3 試驗方法

1.3.1 傳統發(fā)酵乳中乳酸菌的分離純化

發(fā)酵乳梯度稀釋后涂布MRS平板，37℃培養2d。挑取菌落狀態(tài)不同的透明和半透明單菌落，每個(gè)單菌落經(jīng)過(guò)3～4次劃線(xiàn)純化后，37℃，靜置培養24～48h，保存備用。

1.3.2 革蘭氏染色鑒定

挑取待檢菌落于載玻片，滴入生理鹽水稀釋?zhuān)潭ê筮M(jìn)行染色，具體操作見(jiàn)革蘭氏染色液試劑盒說(shuō)明書(shū)，染色后于顯微鏡下觀(guān)察菌體形態(tài)。

1.3.3 CLA含量測定

選取CLA質(zhì)量濃度為0.0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5，15.0μg/mL的樣品，測定吸光度值（λ=233nm），制作標準曲線(xiàn)。選取革蘭氏染色陽(yáng)性菌株接種MRS培養基（0.5mg/mLLA），37℃培養24～48h，加入正己烷充分振蕩，4℃，10000g離心10min，取上清液測定吸光度值（λ=233nm），根據標準曲線(xiàn)計算生成CLA的含量。

1.3.4 16srDNA鑒定菌種

利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取已篩選的乳酸菌基因組，稀釋基因組DNA至終質(zhì)量濃度為20ng/μL，以此為模板，用16s通用引物進(jìn)行PCR擴增，PCR驗證結果呈陽(yáng)性的菌株送交上海派森諾生物科技股份有限公司測序。

1.3.5 單因素試驗

以發(fā)酵乳的質(zhì)構特性、滋味特性和CLA產(chǎn)量作為考察指標，研究植物乳桿菌HAC01接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵pH值、LA添加量，發(fā)酵結束后后熟時(shí)間對發(fā)酵性質(zhì)的影響。利用質(zhì)構儀測定硬度、稠度、黏度、黏聚性等指標，測定條件及參數為：探針選擇直徑為2.5cm的平底圓柱形探針，測定模式選擇阻力測試，感應力選擇自動(dòng)感應10g，測定前下降速度1.0mm/s，測定速率2.0mm/s，測定后速度8mm/s，進(jìn)入樣品深度20mm，對測試樣品進(jìn)行兩次壓縮，間隔時(shí)間5s。利用電子舌測定樣品的綜合味覺(jué)信息，指標包括酸、甜、苦、咸、鮮。

1.3.6 均勻設計

使用DPS數據處理系統V7.05進(jìn)行均勻設計和數據分析，優(yōu)化反應條件。

2 結果與討論

2.1 乳酸菌分離純化

為得到具有較高CLA產(chǎn)量的菌株，本試驗從采集的發(fā)酵乳樣品分離純化菌種，利用菌落形態(tài)和革蘭氏染色進(jìn)行初步鑒定，結果如表1所示，乳酸菌菌落形態(tài)基本呈半透明、圓形隆起狀，革蘭氏染色為陽(yáng)性。

2.2 菌株CLA含量

測定篩選出的25株革蘭氏陽(yáng)性菌的CLA產(chǎn)量，結果見(jiàn)圖1所示，其中產(chǎn)量最高的為7號菌株，CLA產(chǎn)量為（2.7197±0.0056）μg/mL，選取產(chǎn)量相對高的10株菌進(jìn)行后續試驗；CLA標準曲線(xiàn)如圖2所示，由標準曲線(xiàn)得到回歸方程：Y=0.0741X+0.0032，線(xiàn)性相關(guān)系數R²=0.9991。

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