7、體外模擬肽-鋅螯合物胃腸消化及鋅解離率測定

將制備的肽-鋅螯合物溶于pH2.0，37℃去離子水中，充分混勻后向其中添加2％(w/w)的胃蛋白酶，在37℃條件下水浴搖床酶解2h。水解液用分子截留量為500Da的透析袋透析5h，收集透析液，利用原子吸收分光光度計測定其中游離鋅的含量，評價(jià)肽-鋅螯合物在胃消化過(guò)程中的穩定性，同時(shí)收集透析袋內剩余物質(zhì)冷凍干燥備用。

將經(jīng)過(guò)胃蛋白酶消化后的肽-鋅螯合物溶于37℃，pH7．0的水溶液中，充分混勻后添加2％(w/w)的胰酶，在37℃條件下水浴搖床酶解3h。

隨后水解液用分子截留量為500Da的透析袋透析5h，收集透析液，利用原子吸收分光光度計測定其中游離鋅的含量，評價(jià)肽-鋅螯合物在腸消化過(guò)程中的穩定性，同時(shí)收集透析袋內剩余物質(zhì)冷凍干燥備用。

在模擬胃腸消化過(guò)程中，鋅的解離率定義為在胃腸消化過(guò)程中釋放游離鋅的量占消化前酪蛋白肽-鋅螯合物中鋅的總量的百分比。

8、肽-鋅螯合物中鋅的生物利用率

Caco-2細胞培養于25cm²細胞培養瓶中，培養液為含有10％胎牛血清，1％非必須氨基酸，100U/mL青霉素和0.1mg/mL鏈霉素的高糖培養基。培養條件為37℃，相對濕度90％，CO₂濃度為5％。當細胞在培養瓶中分布80％時(shí)，用含0.5％EDTA的胰酶消化細胞，然后以4-5×105cells/mL的濃度接種于6孔Transwell培養板中。

每隔2d換一次培養液，直至細胞培養21d。然后棄去培養液，用HBSS清洗細胞2-3次，在細胞模型上側和下側分別添加1.5mL和3mLHBSS溶液。將經(jīng)胃腸消化后肽一鋅螯合物添加至上側，使其終濃度為1.5mg/mL，隨后將添加了樣品的Transwell培養板在37℃下吸收轉運2h，收集培養板下側的溶液進(jìn)行透析，分別收集透析液和透析后的保留物，然后利用原子吸收分光光度計測定其中鋅的含量，與吸收之前比較，計算經(jīng)吸收過(guò)程后游離鋅的含量及螯合物中鋅的生物利用率。

9、數據處理與統計分析

數據結果表示為平均值±標準誤的形式。采用SPSS19.0(SPSSInc，Chicago，IL)進(jìn)行數據處理分析，利用Duncan檢驗分析各組數據見(jiàn)的顯著(zhù)性差異(α=0.05)。

三、結果與分析

1、酪蛋白肽的分離純化

酪蛋白水解物經(jīng)SephadexC25凝膠柱分離后的譜圖如圖1所示。由圖1可知，共分離得到4組酪蛋白肽組分，F1和F2組分是由流動(dòng)相20mM，pH4.0的醋酸緩沖液洗脫獲得；F3和F4組分是由流動(dòng)相20mM，pH4.0的醋酸緩沖液和0.5MNaCl共同洗脫獲得。本實(shí)驗中分離酪蛋白肽采用的陽(yáng)離子交換柱層析，以SPsephadexC-25作為固定相，其中以帶負電荷的磺酸基(一SO₃H)為主要功能團，通過(guò)靜電相互作用對物質(zhì)進(jìn)行分離。因此，F1和F2組分最先被洗脫下來(lái)，帶有較多的負電荷；F3和F4組分則帶有較多正電荷。由于F3和F4組分的洗脫液中含有NaCI，這兩組分需要經(jīng)過(guò)脫鹽處理。收集足夠量的肽組分后，調節pH為7.0，冷凍干燥后在一80℃條件下存放備用。

2、酪蛋白肽組分的ζ電勢

分離得到的4組酪蛋白組分的表面電荷性質(zhì)通過(guò)ζ電勢進(jìn)行確定。由圖2可知，從F1到F4組分的ζ電勢逐漸增加，分別為-43mV，-32mV，-11mV和3mV，且相互之間存在著(zhù)顯著(zhù)性差異(P＜0.05)。這一測定結果與上述酪蛋白肽組分的分離純化相符合，F1和F2組分帶有較多負電荷，ζ電勢較低；F3和F4組分最后從SPsephadexC-25陽(yáng)離子交換填料上洗脫下來(lái)，所帶負電荷相對較少，因此ζ電勢較高。不同的ζ電勢表明酪蛋白肽組分在水溶液中穩定性不同，同時(shí)也會(huì )影響肽與金屬離子之間的相互作用以及形成金屬螯合物的穩定性。例如，有學(xué)者研究發(fā)現由于含有較多帶負電荷的磷酸基團，酪蛋白磷酸肽在pH變化的條件下仍然能夠與鐵形成穩定的復合物。因此，由于ζ電勢的不同，本實(shí)驗中分離得到的酪蛋白肽組分螯合鋅離子的能力以及形成肽鋅螯合物的穩定性會(huì )存在較大的差異。

3、酪蛋白肽組分的氨基酸組成

活性肽的帶電性質(zhì)在宏觀(guān)上反映了其氨基酸組成的差異。帶有負電荷的組分含有相對較多的酸性氨基酸，而帶有正電荷的組分含有相對較多的堿性氨基酸。采用柱前衍生法對分離得到的酪蛋白肽組分的氨基酸組成進(jìn)行分析，結果如表1所示。F1-F3組分中酸性氨基酸含量高于堿性氨墓酸含量。其中，F1組分中酸性氨基酸(Asp和Glu)含量占總氨基酸含量的42.64％；F2組分中酸性氨基酸含量占33.84％；F3組分中堿性氨基酸(His、Arg、Lys)含量明顯高于F1和F2組分，達到15.33％。因此，F1、F2和F3可看做帶負電荷的組分，掌電勢較低。F4組分中堿性氨基酸含量高于酸性氨基酸含量，堿性氨基酸占氨基酸總數的37.90％。F4為帶正電荷組分，亭電勢較高。此外，有研究報道，具有結合二價(jià)金屬離子能力的氨基酸殘基包括Asp、Glu、His、Ser、Cys、Asn和Gin，這些氨基酸殘基在4組酪蛋白肽組分中的含量分別為55.5％、40.4％、29.4％和26.1％。再結合氨基酸組成分析可知，分離得到的4組酪蛋白肽組分都可以螯合鋅離子，并且螯合鋅的能力從F1組分到F4組分逐漸減弱。

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