作為一種必需的微量元素，鋅對人體的生長(cháng)發(fā)育和免疫系統功能的完善尤其重要。由于體內沒(méi)有專(zhuān)門(mén)的鋅儲藏點(diǎn)，機體需要通過(guò)日常膳食額外補充足夠的量來(lái)維持體內鋅的平衡狀態(tài)。目前全世界發(fā)達國家中大約有22億人口受到鋅缺乏的影響，尤其是嬰兒、孕婦、哺乳期的女性以及老年人受影響最嚴重。因此，促進(jìn)膳食中鋅的吸收成為當前營(yíng)養研究的熱點(diǎn)。

鋅在人體內的生物利用度很大程度上取決于其在小腸內的吸收。食物基質(zhì)中的成分，例如植酸、多酚、皂苷和纖維素等，會(huì )與鋅結合形成不溶性的復合物，從而阻礙鋅的吸收，導致人體鋅缺乏。食物中其他礦物質(zhì)，如鐵、鈣、銅離子也會(huì )競爭性地與載體結合而抑制鋅的吸收。通過(guò)補充無(wú)機鹽(ZnSO₄，ZnO)是一種常見(jiàn)的預防鋅缺乏的手段，但是含鋅的無(wú)機鹽不僅會(huì )改變食物的理化和感官性質(zhì)，還會(huì )引起胃腸道不適，不宜長(cháng)期攝入。有關(guān)食源性多肽作為配體與鋅結合，從而提高鋅的吸收在國內外已有研究，多肽被認為是一類(lèi)非常有潛力的促進(jìn)鋅吸收的物質(zhì)。酪蛋白是牛奶中的主要蛋白質(zhì)，約占總蛋白的80％，是多種生物活性肽的來(lái)源；其中，酪蛋白磷酸肽已經(jīng)被證明能夠與鋅結合，并且具有很好的促鋅吸收效果。但是由于肽一鋅螯合物在胃腸道內穩定性的問(wèn)題，導致鋅的消化吸收和在體內的生物利用率有很大差異。鑒于鋅離子帶有正電荷，肽的結構性質(zhì)尤其是電荷性質(zhì)(正負性和凈電荷量)，通過(guò)靜電相互作用，對其螯合鋅離子的能力以及螯合物在胃腸道內的穩定性至關(guān)重要，會(huì )影響鋅的最終吸收和生物利用率。但是，目前關(guān)于肽的電荷性對肽一鋅螯合物在胃腸道內消化和吸收影響的系統研究缺乏報道。

因此，本實(shí)驗以酪蛋白為原料，經(jīng)堿性蛋白酶水解后采用陽(yáng)離子交換柱層析分離酪蛋白肽，并制備肽-鋅螯合物。實(shí)驗中對分離得到的酪蛋白肽的掌電勢以及氨基酸組成進(jìn)行測定，同時(shí)采用體外胃液-腸液-Caco-2細胞的三段式消化吸收模型模擬肽-鋅螯合物的胃腸消化和吸收，以鋅離子的透析率為主要評判指標，考察肽的電荷性質(zhì)對肽-鋅螯合物胃腸消化穩定性和鋅生物利用率的影響，結果有望為酪蛋白肽在補鋅保健品行業(yè)的應用提供參考。

一、實(shí)驗材料與設備

1、實(shí)驗材料

酪蛋白(產(chǎn)品編號：C3400)，堿性蛋白酶(Alcalase，P4860=2.4U/g)，胃蛋白酶(P7000=250U/mg)，胰酶(P1750，4XUSPspecifications)，異硫氰酸苯酯(PITC，P1034)，三乙胺(Triethylamine，T0886)，17種氨基酸混合標準品(AASl8)購買(mǎi)于Sigma公司；高糖培養基(DMEM)，胎牛血清(FBS)，非必須氨基酸(NEAA)，青霉素-鏈霉素混合液，HBSS(Hank’Sbufferedsalinesolution)，胰酶-EDTA購買(mǎi)于Hyclone公司(ThermoScientific)；25cm²細胞培養瓶(Nunc)，6孔Transwell細胞培養板(Nunc，孔徑0.4μm，面積4.2cm²)，透析袋購買(mǎi)于北京索萊寶公司；ZORBAXSB-C18色譜柱(250×4.6mm，安捷倫)；SephadexC25凝膠柱層析填料，購買(mǎi)于GEHealthcare生命科學(xué)有限公司；Caco-2細胞，購買(mǎi)于中國科學(xué)院上海細胞庫；其他試劑均為分析純，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

2、實(shí)驗儀器

LC-15高效液相色譜儀、AA-7000原子吸收分光光度計，購于島津國際貿易(上海)有限公司；HZS-HA恒溫水浴振蕩器、DL-CJ-1N超凈工作臺，購于哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；RE-52型旋轉蒸發(fā)儀，購于上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；BT-100B數顯恒流泵、HD-5電腦紫外檢測儀、HD-A電腦采集器，均購買(mǎi)于上海青浦滬西儀器廠(chǎng)；Nano-ZS90納米粒度電位儀，購買(mǎi)于英國Malvem公司；Infinite200Pro多功能酶標儀，購買(mǎi)于瑞士TecanTradingAG；3111型二氧化碳培養箱，購于ThermoScientific；LGJ-18冷凍干燥機，購于北京四環(huán)科學(xué)儀器廠(chǎng)。

二、實(shí)驗方法

1、酪蛋白水解

將酪蛋白固體粉末溶于去離子水中，使其濃度為5％(w/v)，用0.5MNaOH調節pH為8.0，將酪蛋白溶液在60℃水浴中預熱10min。隨后向其中添加堿性蛋白酶，堿性蛋白酶的添加量為酪蛋白質(zhì)量的2％，在60℃水浴搖床中酶解4h，在酶解過(guò)程中利用0.0lMHCI和0.5MNaOH控制水解液pH為8.0。酶解結束后，將水解液煮沸滅酶15min，冷卻至室溫后，用0.01MHCI和0.5MNaOH調pH至7.0，隨后在4℃8000r/min條件下離心15min，然后取上清液濃縮后冷凍干燥，-80℃低溫保存。

2、酪蛋白肽的分離

將上述制備得到的酪蛋白水解物復溶于20mM，pH4.0的醋酸緩沖溶液中，使其濃度為400μlg/mL，充分溶解后，采用0.45μm水系濾膜過(guò)濾，濾液經(jīng)SephadexC25凝膠柱層析進(jìn)行分離。在0～120min內，采用醋酸緩沖溶液(20mM，pH4.0)作為洗脫液進(jìn)行洗脫；120～240min內，采用醋酸緩沖溶液(20mM，pH4.0)+0.5MNaCI作為洗脫劑進(jìn)行洗脫。整個(gè)洗脫過(guò)程中，控制蠕動(dòng)泵的流速為3.0mL/min。洗脫液采用紫外檢測器檢測，波長(cháng)為220nm，采用系統自帶的HD-A色譜處理系統記錄分離過(guò)程中圖譜的變化，根據監測到的樣品峰進(jìn)行樣品收集。收集得到的酪蛋白肽組分經(jīng)旋轉蒸發(fā)濃縮后，冷凍干燥，一80℃避光保存。

3、酪蛋白肽組分的ζ電勢測定

酪蛋白肽組分ζ電勢采用電位分析儀進(jìn)行測定。酪蛋白肽溶于去離子水中，充分混勻后使其濃度為1mg/mL。隨后利用納米粒度電位儀對分離得到酪蛋白肽組分的ζ電勢進(jìn)行測定，分析時(shí)毛細管樣品池需在25℃條件下平衡120S。

4、氨基酸組成分析

準確稱(chēng)取2g待測樣品于具塞玻璃試管中，然后加入2.0mL6M的鹽酸，隨后在110℃烘箱中進(jìn)行全水解24h。水解結束后，在40℃烘箱中烘干。隨后用去離子水進(jìn)行溶解，使其濃度為2mg/mL，取200此于棕色瓶中，向其中添加100μL0.1M的異硫氰酸苯酯和100μL1M的三乙胺，旋渦振蕩后，放置于室溫黑暗條件下反應1h。反應結束后，向上述反應體系中加入400μL正己烷，旋渦振蕩混勻，靜置10min后吸取下層液體，過(guò)0.22μm水系濾膜后進(jìn)行高效液相色譜分析。液相條件如下，流動(dòng)相A：10mM，pH6.9的磷酸緩沖液；流動(dòng)相B：乙腈。洗脫梯度：1～5min，5～10％B；5～25min，10～21％B；25～45min，21～35％B；45～48min，35～100％B；48～50min，100％B；50～58min，100～5％B；58～60min，5％B。

流速：1.0mL/min，檢測波長(cháng)：254nm，進(jìn)樣量：5μL。采用與上述相同的方法對氨基酸標準品進(jìn)行測定，然后以濃度對峰面積作出氨基酸標準品曲線(xiàn)。每種氨基酸的含量表示成g/100g。

5、鋅螯合能力測定

酪蛋白肽的鋅螯合能力的測定參考Jakob等的方法。將樣品溶于40mM羥乙基哌嗪乙磺酸-KOH緩沖溶液中(pH7.5)，使其濃度為1Mg/mL。取250mL樣品溶液與125μL8mM的二硫蘇糖醇和125μL250μM的ZnS0₄+7H20混合，充分混勻后在37℃條件下反應10min，隨后向其中加入25μL2mM的4-(2-吡啶偶氮)間苯二酚，混勻后在500nm處測定吸光值。同時(shí)以不加酪蛋白肽樣品作為空白組，以EDTA作為陽(yáng)性對照組進(jìn)行試驗。鋅螯合能力的計算公式如下：

C=[(A_空白一A_樣品)/A_空白]×100。

6、肽-鋅螯合物的制備

將ZnS0₄·7H₂0溶于pH7.0的磷酸鹽緩沖液中，濃度為50μM，隨后將酪蛋白肽溶于上述溶液中，使其終濃度為10mg/mL，混勻后，在室溫下攪拌反應1h。隨后，用分子截留量為500Da的透析袋透析5h，去除反應液中的游離鋅，收集透析袋內的保留物冷凍干燥后得到肽-鋅螯合物。

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