2.3.3質(zhì)粒外源插入區

p707804?CTXM和pP12375?CTXM均只含一個(gè)MDR區。p707804?CTXM中Tn6810為新型轉座子，包含β?內酰胺類(lèi)耐藥基因blaCTX?M?3、blaOXA?1和blaTEM?1，氨基糖苷類(lèi)耐藥基因aacA4，氯霉素耐藥基因catB3，利福平耐藥基因arr3以及磺胺類(lèi)耐藥基因sul1。

Tn6810（圖3）由Tn3家族的Tn1696進(jìn)化而來(lái)，為T(mén)n1696的衍生物，插入在質(zhì)粒復制相關(guān)區與穩定相關(guān)區的基因間隙中，其兩端為同源重組形成的5 bp正向重復序列（direct repeat;target site duplication,DR)ATACA。Tn1696是Tn3家族Tn21亞群的單元轉座子（unit transposon），由1型整合子In4插入至res（重組位點(diǎn)，resolution site）位點(diǎn)形成，其結構為：IRL(inverted repeat left,5'端反向重復序列）?tnpA（轉座酶基因）?tnpR（解離酶基因）?res?mer（汞抗性位點(diǎn)）?IRR(inverted repeat right,3'端反向重復序列）[22]。相較Tn1696,Tn6810有兩點(diǎn)明顯不同：(1)IRL被插入序列IS4321R打斷成兩段；(2)In1684替代了Tn1696的In4。

In1684為簡(jiǎn)單1型整合子（concise class 1 inte?gron），包含5'?CS、基因盒（gene cassette array,GCA）和3'?CS，基因盒為aacA4-blaOXA?1-catB3-arr3，分別為氨基糖苷類(lèi)、β?內酰胺類(lèi)、氯霉素和利福平耐藥基因（圖3）。Tn6320插入至3'?CS的qacED1中，使In1684被打斷，兩端形成5 bp DR(TAATC）；同時(shí)Tn6502插入至blaTEM?1下游介導blaCTX?M?3轉移。

pP12375?CTXM的MDR區插入至orf531，把orf531打斷，形成兩端5 bp DRs(AACTA），其由Tn6322（含汞抗性位點(diǎn)，mer locus）、ISKpn25、IS1R、In609、IS26以及ΔISPa38構成（圖4）。In609為復合1型整合子（complex class 1 integron），包括5'?CS、VR1(variable region，可變區）/GCA、VR2和3'?CS,VR1為基因盒：gcuD2-aacA4′-17（氨基糖苷類(lèi)耐藥基因）-gcuE14-catB8（利福平耐藥基因），VR2為ISCR1及其下游的blaCTX?M?9。

3 討論

目前，產(chǎn)ESBL菌株的出現已較為普遍，移動(dòng)元件包括質(zhì)粒攜帶β?內酰胺耐藥基因是主要原因。其中β?內酰胺類(lèi)耐藥基因blaCTX?M通常存在于IncF、IncI、IncN、IncHI2和IncL/M等質(zhì)粒中，由插入序列ISEcp1或ISCR1介導，形成如Tn6502(ISEcp1-blaCTX?M?3-orf477）或Tn6503(ISEcp1-blaCTX?M?14-IS903D）轉座單元，在blaCTX?M和其他ESBL基因轉座過(guò)程中扮演重要角色，在相同或不同種屬的腸桿菌科細菌間進(jìn)行水平轉移和傳播。ISEcp1屬于IS1380家族，與普通的插入序列不同，ISEcp1為單末端插入序列，僅靠單個(gè)插入序列即可介導其下游鄰近的耐藥基因進(jìn)行轉移，從而大大提高了耐藥基因轉移的概率。ISCR通過(guò)滾環(huán)復制，導致含有相鄰耐藥基因的環(huán)形DNA分子形成，從而插入到其他位置，常見(jiàn)的為插入到1型整合子3'?CS下游形成VR2區。

非脫羧勒克菌中的blaCTX?M并不多見(jiàn)，目前關(guān)于攜帶blaCTX?M?3/blaCTX?M?9的非脫羧勒克菌，美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI)(https：//www.ncbi.nlm.nih gov/search/）中僅有3例，如2012年韓國報道了攜帶blaCTX?M?3和blaTEM?1的菌株（登錄號：JX129230）但并未測得基因組全序；本研究室前期已發(fā)現1株攜帶blaCTX?M?9的IncR型質(zhì)粒（登錄號：MK036885）的非脫羧勒克菌，以及收集了1株攜帶blaCTX?M?3的勒克屬菌株119287（登錄號：CP046445）。

箭頭表示基因，不同顏色代表不同的基因功能分類(lèi)；陰影部分表示同源區域；核苷酸同源性>95%

本研究中，pP12375?CTMX的MDR區內，blaCTX?M?9由ISCR1介導，插入至整合子的3'?CS，其與本研究室前期發(fā)現的攜帶blaCTX?M?9的p16005813C(IncR）質(zhì)粒的結構極為相似（圖4）。菌株16005813分離自寧波李惠利醫院呼吸內科患者痰液標本，這兩株菌來(lái)自不同省份、pP12375?CTXM與p16005813C質(zhì)粒類(lèi)型不同卻攜帶較為相似的移動(dòng)元件，其主要差異有：(1)p16005813C中MDR區總長(cháng)較長(cháng)：不僅骨架部分較長(cháng)，且外源插入也較多，相較pP12375?CTXM，增多了ΔTn9、ISKpn25以及其他6個(gè)IS;(2)pP12375?CTXM中無(wú)IS26?tet(A）?IS26 unit，僅存在單個(gè)IS26。Tn6810中，blaCTX?M?3由ISEcp1介導，通過(guò)識別其自身的IR和Tn6502下游另外一個(gè)與IRR?1序列高度相似的IRR?2(5'?TTAATGAATTGGGG?3'）介導Tn6502整體在細菌間的傳播。

攜帶blaCTX?M等多種耐藥基因的質(zhì)粒p707804?CTXM和pP12375?CTXM分別介導非脫羧勒克菌150707804和P12375對青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)和單環(huán)β?內酰胺類(lèi)抗生素耐藥。p707804?CTXM為攜帶blaCTX?M?3的首個(gè)非脫羧勒克菌測序質(zhì)粒，表明這兩個(gè)質(zhì)粒分別是該耐藥菌攜帶多種耐藥基因的重要載體，是耐藥菌傳播和擴散的基礎，為闡明非脫羧勒克菌多重耐藥機制提供了更多依據。

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