5α-還原酶（5α-Reductase,5α-R）是至關(guān)重要的雄激素新陳代謝酶，睪酮素（Testosterone,T）在5α-還原酶（5α-R）的效果下不可逆地轉換雙氫睪酮（Dihydrotestosterone,DHT），全過(guò)程中還需要依靠氧化性輔酶II（NADPH），如圖所示1所顯示。DHT是最強的活力雄激素，因為它與雄激素蛋白激酶（Androgenreceptor,AR）的中和作用比T高2~5倍，誘發(fā)AR數據信號傳遞的效果比T高10倍可引起雄激素依賴(lài)感病癥例如痘痘、雄性激素原性掉發(fā)、女士多毛癥、前列腺腫瘤、前列腺增大、假兩性畸形等。

5α-R是肌膚中最重要的雄激素新陳代謝酶，它具備三種同工酶，在其中I型和II型酶的特點(diǎn)非常清楚，二者的關(guān)鍵差異為5α-RI關(guān)鍵出現于肝部及非男性生殖器官肌膚，其充分發(fā)揮生理學(xué)功效的適宜pH為范疇較寬為6~9，而5α-RII關(guān)鍵存有男性前列腺、男性睪丸、附睪囊腫、精囊腺、頭皮毛囊等，其適宜pH為5.5。

現階段已研發(fā)的5α-R緩聚劑包含甾類(lèi)類(lèi)和非甾體類(lèi)，最常用藥品如非那雄胺片、度他雄胺、愛(ài)普列特等。但這類(lèi)藥品存有副作用，如象征性藥品非那雄胺片很有可能對男人導致，抑郁癥、焦慮情緒、認知功能障礙、勃起功能障礙、性欲低下、男士乳房女人化、肌肉生長(cháng)損傷等不良反應，通稱(chēng)為非那雄胺片后綜合癥（Post-finasteridesyndrome,PFS）。

這種不良反應是這類(lèi)藥自身具有的，無(wú)法根據更新改造構造來(lái)清除，因而從純植物中找尋安全性、合理且來(lái)源于普遍的5α-R緩聚劑取代這種有機合成的緩聚劑己變成 世界各國科研的網(wǎng)絡(luò )熱點(diǎn)。Niederprüm等根據體外實(shí)驗確認了鋸葉棕果子提取液具備5α-R抑止活力及其醫治前列腺增大的實(shí)際效果。WeisserH等發(fā)覺(jué)鋸葉棕提取液IDS89對人會(huì )男性前列腺上皮細胞和質(zhì)間中的5α-R具備抑制效果，且歸屬于非競爭抑止，相關(guān)成分是可皂腳亞成分中的月桂酸，它對上皮細胞和基本材料的較大 抑制率分別為52％和45％。鄧桂球等從雌蟲(chóng)大白鼠肝部、男性大白鼠附睪囊腫機構中各自獲取I型、Ⅱ型5α-R，選用HPLC測定方法出紅花提取液對I型、Ⅱ型5α-R活力均有控制實(shí)際效果，抑制率各自做到88.12%和61.65%。此外也是有科學(xué)研究報導黃連非州臀果樹(shù)、大蕁麻、熏衣草、蓮子芯等綠色植物的提取液具備優(yōu)良的5α-R抑止活力，是純天然來(lái)源的5α-R緩聚劑。

油荼葉是山茶科綠色植物油茶樹(shù)CamelliaOleifera的葉，《中華本草》中提及其味有點(diǎn)苦，性溫，有醫治鼻衄，皮膚潰爛發(fā)癢，瘡疽的作用。羅曉偉等早已證實(shí)油茶樹(shù)蒲具備5α-R抑止活力，油荼葉與油茶樹(shù)蒲同是油茶樹(shù)的關(guān)鍵構成部分，推斷油荼葉與油茶樹(shù)蒲很有可能具備相似的生物活性。文中以5α-R為科學(xué)研究靶標，致力于研究油荼葉提取液對5α-R活力的危害，討論其變成潛在性的5α-R緩聚劑的概率，并剖析其成分，為其在醫治雄激素依存性病癥如痘痘、前列腺腫瘤等給予理論來(lái)源。

1原材料與方式

1.1原材料與儀器設備

新鮮采收的油荼葉，浙江江山市河山中間生物技術(shù)有限責任公司給予；SPF等級男性大白鼠4只，休重（200±20）g，由浙江醫學(xué)科學(xué)院給予，許可證號SCXK（浙）2019-0002；還原型輔酶II，Bradford蛋白質(zhì)濃度值測定試劑盒，上海市碧云天；度他雄胺、睪酮素、沒(méi)食子酸、蘆丁剖析標準品，上海市阿拉??；色譜儀級工業(yè)甲醇等有機化學(xué)實(shí)驗試劑均來(lái)源于國藥控股化學(xué)藥品有限責任公司。

高效率液相色譜儀Waterse2695，英國Waters企業(yè)沃特世；LunaC18(2)離子交換柱（4.6mm×250mm,5μm），英國Phenomenex企業(yè)；UltimateUHPLCLP-C18色譜柱（2.1mm×150mm,1.8μm），上海市月旭；AcquityTMUltra型超高效率液相色譜，英國Waters企業(yè)；SciexTripleTOF5600 四級桿航行時(shí)間質(zhì)譜儀器，英國ABSciex企業(yè)。

1.2實(shí)驗方法

1.2.1粗酶提取液的制取及其5α-R成分的測量

參照張蓓的辦法并稍加改動(dòng)，取男性大白鼠4只，忌食禁不住水留宿后脫位處決?？焖偃「尾?，脫離脂肪細胞，秤重，剪下來(lái)，放置量杯，添加急冷的提酶緩沖溶液（提酶緩沖溶液：0.32mol/L綿白糖；0.1mmol/LDTT；1mmol/LEDTA；20mmol/L聚磷酸鹽緩沖溶液pH7.4）依照1:4（w/v）的占比在冰水浴選用勻漿器勻漿，做成勻漿體，隨后將其散裝至離心管架，在4℃、10,000×g標準下離心式20min，去除懸浮的人體脂肪，取頂層液態(tài)，一樣情況下再離心式1h，上清液即是微粒體粗提取液。選用Bradford法對粗酶提取液定量分析，因其總蛋白質(zhì)含量表明5α-R的成分。

1.2.25α-R酶促反應管理體系的確立與5α-R活力測量

1.2.2.1T標曲的制取

配置系列產(chǎn)品濃度值T水溶液：5μmol/L~2000μmol/L，將差異濃度值T水溶液用0.22μm微孔濾膜過(guò)慮至高效液相瓶，進(jìn)到高效率液相色譜檢驗，以峰總面積A（AU*min）為縱軸，以T濃度值C（μmol/L）為橫坐標軸，制作標曲。

液相色譜儀標準：

離子交換柱：LunaC18(2)柱（4.6mm×250mm,5μm）不銹鋼板柱；柱溫：30℃；流動(dòng)性相：工業(yè)甲醇/水70/30（V/V）；流動(dòng)速度：1.0mL/min；檢驗光波長(cháng)：242nm；氣相容積：20μL。

1.2.2.25α-R酶促反應管理體系的創(chuàng )建

在1000μL測活管理體系中，將300μLPBS緩沖溶液（pH7.4）、500μL粗酶提取液封閉液、50μLT、50μL50%酒精、100μLNADPH按序添先后加至離心管架，于漩渦混和儀迅速混和勻稱(chēng)3s，37℃恒溫水浴鍋反映30min，在t0時(shí)刻與t30時(shí)刻迅速各自抽樣400μL，迅速添加800μL工業(yè)甲醇（工業(yè)甲醇具有降解胰蛋白酶的功效），渦流5s停止反映。以上反映液在12,000r/min離心式15min，除蛋白質(zhì)，取上清液，0.22μm有機相濾紙過(guò)慮至高效液相瓶，待檢驗。

1.2.2.35α-R活力測量

HPLC檢驗較為反映前t0時(shí)刻與反映后t30時(shí)刻T峰總面積的轉變，液相色譜儀標準同1.2.2.1。將T峰總面積帶到T標曲，測算出相對應濃度值，及其T濃度值的變化量，進(jìn)而完成測量5α-R的活力。設定不一樣的反映管包含：空白試驗管（酶提取液用工業(yè)甲醇降解）、酶一切正常反映管、陽(yáng)性對照管（50%酒精換為度他河北雄安水溶液）。

計算方法如下所示：

△T（μmol/L）=Ct0–Ct30（1）

Ct0表明0min時(shí)T濃度值，Ct30表明30min時(shí)T濃度值，△T表明反映前后左右T濃度值的誤差。

5α-R活力（μmolT/gprot·30min）=（Ct0–Ct30）/C5α-R（2）

界定5α-R活力（μmolT/gprot·30min）為1克酶提取液每30min轉換T的量，C5α-R（g/L）表明5α-R粗提取液的濃度值，即5α-R粗提取液蛋白的濃度值。

1.2.35α-R酶促反應管理體系的提升

1.2.3.1反映系統中NADPH、T、粗酶提取液適合加上濃度值的明確

將NADPH用PBS配置成一系列梯度方向：0.5mmol/L、1mmol/L、1.5mmol/L、2mmol/L、2.5mmol/L，選用1.2.2中提及的5α-R活力測定法，在固定不動(dòng)5α-R提取液濃度值為0.76mg/mL、T濃度值為1mmol/L的標準下，以5α-R活力為指標值，調查NADPH的適合加上濃度值。

將T配置成一系列梯度方向：0.025mmol/L、0.1mmol/L、0.4mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L，選用1.2.2中提及的5α-R活力測定法，在固定不動(dòng)5α-R提取液濃度值為0.76mg/mL，NADPH濃度值為2mmol/L的標準下，以5α-R活力為指標值，調查T(mén)的適合加上濃度值。

以蛋白濃度值表明粗酶提取液的濃度值，將其用PBS（pH7.4）緩沖溶液稀釋液成系列產(chǎn)品梯度方向：0.38mg/mL、0.76mg/mL、1.52mg/mL、3.03mg/mL、6.06mg/mL，選用1.2.2中提及的5α-R活力測定法，在固定不動(dòng)T濃度值為2mmol/L，NADPH濃度值為2mmol/L的標準下，以5α-R活力為指標值，調查粗酶提取液的適合加上濃度值。

1.2.3.2反映管理體系可靠性的調查

明確最后反映管理體系每個(gè)成分的濃度值標準：76mg/mL粗酶提取液500μL，2mmol/LT50μL，試品50μL，2mmol/LNADPH100μL，各自測量四次空白試驗管和酶一切正常反映管的T濃度值轉變，調查反映機制的反復性和可靠性，測算相對偏差RSD。

1.2.3.3度他雄胺5α-R抑止活力的測量

度他雄胺是Ⅰ型5α-R緩聚劑，將其為呈陽(yáng)性藥品并稀釋液成系列產(chǎn)品梯度方向：2nmol/L、4nmol/L、6nmol/L、8nmol/L、12nmol/L、16nmol/L，選用1.2.2中提及的5α-R活力測定法，在合適的NADPH濃度值、T濃度值、粗酶提取液濃度值情況下，把50%乙醇溶液換成系列產(chǎn)品濃度值的度他雄胺水溶液，調查不一樣濃度值度他雄胺對5α-R活力的抑制率，制作抑止曲線(xiàn)圖，測算出度他雄胺對5α-R活力的半抑止濃度值（IC50），公式計算如下所示：