γ-氨基丁酸(GABA)是一種四碳非蛋白碳水化合物，是由磷酸脫羧酶不可逆、專(zhuān)一地將L-磷酸的α-羧基脫去-分子結構CO₂獲得，是高寬比溶解水的兩性離子，pK值為4.03和10.56，因而主要表現出與此類(lèi)碳水化合物相近的身理活力，即做為一種抑制型遞質(zhì)存有于哺乳類(lèi)動(dòng)物的神經(jīng)中樞體系中?，F階段普遍使用于工業(yè)生產(chǎn)、寵物飼料、藥業(yè)和食品企業(yè)。

很多研究表明，GABA有有助于睡眠、提高記憶力、抗焦慮、防止和醫治癲癇、減緩腦變老、緩解毛細血管、調整生長(cháng)激素代謝、提升 受胎率、消除氨毒、提高肝臟功能等功效。

現階段制取GABA的辦法具體有綠色植物聚集法、有機合成法、生物發(fā)酵法、酶催化反應法。綠色植物聚集法生產(chǎn)制造GABA盡管安全環(huán)保，但GABA濃度值低，尚沒(méi)法作為藥品、食用添加劑；有機合成法生產(chǎn)制造GABA安全系數較弱、有化工殘余，也不容易做到藥業(yè)及食品企業(yè)的規范：生物發(fā)酵法取得的GABA是一個(gè)多相繁雜管理體系，濃度值低，中下游物質(zhì)分離出來(lái)成本增加，是生產(chǎn)制造高純、濃度較高的GABA的一個(gè)發(fā)展瓶頸。因此 ，現階段制取GABA多選用酶催化反應法，主要是使用微生物菌種體細胞內分離出來(lái)獲得的磷酸脫羧酶或可以生產(chǎn)制造磷酸脫羧酶的微生物菌種體細胞專(zhuān)一、不可逆地脫下L-磷酸的α-羧基，進(jìn)而獲得濃度較高的、高純的GABA。此辦法的特點(diǎn)是反映標準柔和、不用高昂的原材料、耗能低，而且微生物菌種來(lái)源于的磷酸脫羧酶和可以生產(chǎn)制造磷酸脫羧酶的微生物菌種體細胞可利用簡(jiǎn)潔的細胞培養基很多獲得。

現階段大多數科學(xué)研究以大腸埃希菌為寄主表述GAD，催化反應生產(chǎn)制造GABA。在資產(chǎn)重組菌發(fā)醇全過(guò)程中加上一定含量的輔酶磷酸吡哆醛(PLP)可以推動(dòng)GAD的伸縮，進(jìn)而提升 GAD酶魅力。此外，酶催化反應法即運用GAD將磷酸脫去一分子CO₂制取GABA全過(guò)程中，在酶轉換管理體系中加入一定量的PLP能夠推動(dòng)酶液或全體細胞的轉換舊。有學(xué)者報導了在大腸埃希菌發(fā)醇全過(guò)程中同時(shí)加上0.02mmol/LPLP后，GABA生產(chǎn)量是對比的2.0～2.5倍?？墒荘LP價(jià)格比較貴，在進(jìn)行發(fā)酵全過(guò)程和酶轉換管理體系中同時(shí)加上毫無(wú)疑問(wèn)大大增加產(chǎn)品成本。因為大腸埃希菌本身具有吡哆醛蛋白激酶(PdxK)遺傳基因和硫酸銨吡哆醇抗霉素(PdxH)遺傳基因，進(jìn)而產(chǎn)生PLP挽救方式(見(jiàn)圖1)。輔酶磷酸激酶吡哆醇(PN)、吡哆胺(PM)和吡哆醛(PL)上57羥甲基根據PdxK使其磷酸化，轉化成相應的輔酶中問(wèn)體硫酸銨吡哆醇(PNP)和硫酸銨吡哆胺(PMP)及其輔酶磷酸吡哆醛(PLP)，PdxH進(jìn)一步催化反應PNP或PMP的氧化還原反應，轉化成輔酶PLP，輔酶PLP的提升可推動(dòng)GAD的伸縮，提升 GAD酶魅力。黃燕等科學(xué)研究了在大腸埃希菌發(fā)醇全過(guò)程中加上PN后，酶活是對照實(shí)驗(不加上PN)的1.8倍。

可是大腸埃希菌為非食品衛生安全菌種，在進(jìn)行發(fā)酵全過(guò)程中容易造成類(lèi)毒素，而且必須 加上價(jià)格比較貴且有侵害功效的IPTG做為誘導劑誘發(fā)產(chǎn)酶，其生產(chǎn)制造取得的GAD安全系數不高，間距達到食品類(lèi)和制藥方面的需求也有一定差別?？莶菘莶菅挎呔歉鶕绹称泛退幬锕芾砭諫ARS驗證的安全性菌種，廣泛運用在食品類(lèi)、藥業(yè)制造中。殊不知在枯草枯草芽孢菌中缺乏PdxH，因此沒(méi)法運用加上輔酶磷酸激酶PN的方法，根據PLP挽救方式將PN轉換為PLP，進(jìn)而提升 GAD酶魅力?，F階段，很多的科研集中化在以枯草枯草芽孢菌為寄主生產(chǎn)制造GAD，在酶轉換全過(guò)程中根據立即加上輔酶PLP提升 轉換高效率，如丁偉等應用安全性寄主枯草枯草芽孢菌生產(chǎn)制造GABA，在其轉換全過(guò)程巾立即加上PLP，全體細胞催化反應GABA生產(chǎn)量為239.91g/L，轉換率54.48％。因為PLP價(jià)格比較貴，造成 產(chǎn)品成本較高，沒(méi)法融入工業(yè)生產(chǎn)要求。有關(guān)在枯草枯草芽孢菌為寄主生產(chǎn)制造GAD發(fā)醇全過(guò)程中，加上質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的輔酶磷酸激酶以提升 GAD酶魅力的探究末見(jiàn)報導。因而創(chuàng )作者以枯草枯草芽孢菌(Bacillussubtilis)為寄主，根據基因工程技術(shù)將大腸埃希菌來(lái)源于的磷酸脫羧酶遺傳基因(gadB)在B.sMbtilis中異源表述，加上相對性便宜的輔酶磷酸激酶PL，根據PdxK受體的PLP挽救方式將其轉換轉化成PLP(見(jiàn)圖2)，進(jìn)而提升 酶活和生產(chǎn)量，減少產(chǎn)品成本。

1 原材料與方式

1.1 原材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

質(zhì)粒EcoliJMl09/pET-24a( )-gadB為創(chuàng )作者所屬試驗室早期搭建，菌種B.5Mbtilis和表達載體pHY300PLK(含啟動(dòng)子P_HfpaH和P_armyQ，沒(méi)有信號肽)由創(chuàng )作者所屬試驗室儲存。

1.1.2 培養液

LB液體培養基(g/L)：各自稱(chēng)量氧化鈉10g、發(fā)酵粉5g、蛋白胨10g，溶解1L雙蒸水中，并根據加上2mol/LNaOH或HCl調整pH至7.0。

LB固態(tài)瓊脂粉培養液：LB液體培養基中加上濃度值為20g/L的瓊脂粉。

高滲液體培養基：LB液體培養基巾加上0.5mol/L山梨糖醇。

電鉆培養液：LB液體培養基中分別加上0.5mol/L山梨糖醇和甘油果糖，濃度值為100g/L的葡萄糖水。

RM培養液：LB液體培養基中加上0.5mol/L山梨糖醇和0.38mol/L甘油果糖。

TB培養液(g/L)：各自稱(chēng)量發(fā)酵粉24g、蛋白胨12g、凡士林5g、三水磷酸氫二鉀16.43g、磷酸二氫鉀2.31g，溶解1L雙蒸水中，并加上2mol/LNaOH或HCl調整pH至7.0。

1.1.3 實(shí)驗試劑

pH至7.0。1.1.3實(shí)驗試劑QuickcutHindⅢ約束性?xún)惹忻福嘿徸訲aKaRa生物技術(shù)技術(shù)性有限責任公司；2xphantaMaxMasterMix、ExnaseⅡ無(wú)縫連接檢測試劑盒：購自諾唯贊(南京市)生物技術(shù)有限責任公司；DL-10000DNAMarker、氨芐青霉素、四環(huán)素：購白寶生物有限責任公司；質(zhì)粒提取檢測試劑盒、瓊脂糖電泳DNA同收檢測試劑盒：購白天根生化高新科技(北京市)有限責任公司

UnstainedProteinMWMarker標準蛋白質(zhì)品、蛋白質(zhì)膠制取檢測試劑盒：購自碧云天生物技術(shù)性有限責任公司：分子結構級的蛋白胨和發(fā)酵粉：購自美國Oxiod企業(yè)：別的基本實(shí)驗試劑：購自國藥集團化學(xué)藥品有限責任公司。

1.1.4 關(guān)鍵儀器設備

PCR儀：購自英國B(niǎo)io-Rad公司：722型紫外線(xiàn)由此可見(jiàn)光度計：購白上海儀電分析儀有限責任公司：冷藏式離心脫水機：購自Beckmancoulter企業(yè)：KQ-250E型超音波體細胞破碎機：購自寧波新芝生物技術(shù)股權有限責任公司；pH計：購自法國Mettler-Toledo企業(yè)：高效率液相色譜：購自安捷倫科技有限責任公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 引物設計

以質(zhì)粒pET-24a( )-gadB為模版，依據無(wú)縫拼接復制同宗臂設計原理各自設計方案正、反方向引物設計：正方向弓I物(F1)：57-GGAGTGTCAAGAATGGACCAGAAGCTGTTAACGGA-3'：反方向引物設計(R1)：5'-‘ITTATTACCAAGCTTTCAGGTGTGTTTAAAGCTGTTC-3’。

以質(zhì)粒pHY300PLK為模版，依據無(wú)縫拼接復制同宗臂設計原理各自設計方案正、反方向引物設計：
正方向引物設計(F2)：5'-TCAAATAAGGAGTGTCAAGAATG-3’：反方向引物設計(R2)：5’-GGTGTTTTTTTACCAAGCTT-3’。
將制定好的引物設計送至蘇州市金唯智生物技術(shù)公司生成。

1.2.2 目的基因和表達載體的獲得

以試驗室儲存的質(zhì)粒pET-24a( )-gadB為模版，F1/R1為正反面向引物設計增加gadB目的基因；PCR反映管理體系(50μL)：5×PSBuffer10μL、ddH₂034μL、dNTP4μL、模版DNA0.5μL，正、反方向引物設計各0.5μL，PrimerSTARPolymerase0.5μL。

PCR程序流程：94℃預轉性5min，98℃轉性10S，55℃淬火5S。72℃拓寬2min，轉性至拓寬全過(guò)程開(kāi)展29個(gè)循環(huán)系統：72℃拓寬10min；4℃儲存。

以質(zhì)粒pHY300PLK為模版，F2/R2為正反面向引物設計增加表達載體；PCR反映管理體系(50μL)：5×PSBuffer10μL、ddH₂O34μL、dNTP4μL、模版DNA0.5μL,正、反方向引物設計各0.5μL，PrimerSTARPolymerase0.5μL。

PCR程序流程：94℃預轉性5min，98℃轉性10s，55℃淬火5S，72℃拓寬6min，轉性至拓寬全過(guò)程開(kāi)展29個(gè)循環(huán)系統：72℃拓寬10min；4℃儲存。

目的基因和表達載體PCR雜帶根據瓊脂糖核苷酸電泳原理開(kāi)展認證。

1.2.3 目的基因和表達載體的聯(lián)接與評定

1.2.2已認證準確的PCR物質(zhì)根據瓊脂糖疑膠同收檢測試劑盒開(kāi)展回收利用?；厥绽煤蟮腜CR物質(zhì)用ExnaseⅡ連接酶聯(lián)接，其聯(lián)接管理體系如下所示：ddH₂O5.3μL、5×CEBuffer2μL、ExnaseⅡ1μL、表達載體1.16μL、目的基因0.54μL，放置PCR儀37℃反映30min進(jìn)行聯(lián)接。

選用大腸埃希菌JMl09熱擊轉化法后，將轉換細胞液施膠至含100μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養基上，在37℃恒溫培養箱顛倒塑造10～12h，挑菌單菌體至含100μg/mL氨芐青霉素的10mLLB液體培養基中，放置振蕩培養箱37℃、200r/min塑造8～10h后搜集菌體，并獲取質(zhì)粒便于認證和開(kāi)展事后試驗。將獲取的質(zhì)粒開(kāi)展HindⅢ酶切認證準確后送到蘇州市金唯智生物技術(shù)有限責任公司轉錄組測序。將轉錄組測序恰當的質(zhì)粒根據觸電轉化法導進(jìn)表述寄主B.Subtilis中，將轉換細胞液施膠至含20μg/mL四環(huán)素的LB共體培養液上，在37℃恒溫培養箱顛倒塑造10～12h，挑菌單菌體至含20μg/mL四環(huán)素的10mLLB液體培養基中，放置振蕩培養箱37℃、200r/min塑造8～10h后搜集菌體，并獲取質(zhì)粒開(kāi)展酶切認證。