微生物菌種的發(fā)育繁育和排泄是造成 食品類(lèi)腐壞變味的主要要素。病菌人群磁感應（QuorumSenSIng，QS）是一種取決于體細胞相對密度的數據溝通方法，以自誘發(fā)物（AuToInducerS，AIS）為人群磁感應信號分子，它根據管控食品類(lèi)中優(yōu)點(diǎn)腐壞菌的成長(cháng)新陳代謝來(lái)管控食品類(lèi)腐壞過(guò)程。研究表明，人群磁感應緩聚劑可根據與AIS受體蛋白融合，溶解AIS分子結構和阻隔人群磁感應通道等方式合理影響病菌人群磁感應的表述，減少食源性病菌的高致病或致腐性。運用人群磁感應緩聚劑靶向治療管控病菌的人群磁感應系統軟件來(lái)抑止食品類(lèi)腐壞，已變成食品保鮮行業(yè)的科研熱門(mén)之一。

近些年，科學(xué)研究專(zhuān)家在新鮮水果、蔬菜水果和中藥材等植物提取的提取液中挑選到許多安全性、合理的活力成份，這種化學(xué)物質(zhì)做為人群磁感應緩聚劑可合理減少微生物菌種的毒副作用。大蒜提取物是具備人群磁感應抑止活力的化學(xué)物質(zhì)，能在亞抗菌濃度值下阻隔N-?；呓z氨酸內酯（AHLS）信號分子受體的人群磁感應系統軟件，抑止其感病因素造成，殊不知，現階段有關(guān)大蒜提取物對腐壞菌腐壞工作能力的影響功效仍難得少有報導。

本實(shí)驗以在發(fā)醇魚(yú)漿中挑選到的腐壞菌維氏氣單胞菌為目標，剖析其AHLS受體的人群磁感應狀況，研究大蒜提取物對該病菌產(chǎn)AHLS活力、生物膜系統產(chǎn)生工作能力、感病基因的表達和致腐工作能力的影響功效，以求運用大蒜提取物等人群磁感應緩聚劑做為食品保鮮劑，提升食物的安全系數和貨架期。

1 原材料與方式

1.1 原材料與實(shí)驗試劑

原材料：新鮮蒜頭，購于杭州潮王路農貿市場(chǎng)；魚(yú)漿，A級海產(chǎn)品銅盆魚(yú)糜，由上虞市傣之味食品類(lèi)有限責任公司給予，儲藏于-18℃冰柜中，預留。菌苗：維氏氣單胞菌，分離出來(lái)于發(fā)醇魚(yú)漿，加上20%凡士林，儲存于本試驗室-80℃冰柜中。根癌農桿菌[AgrobActeriumtumefAeiensA136（PcF218/PcF372）]，壯觀(guān)霉素抵抗性，使用量為50μg/mL。

實(shí)驗試劑：苯甲酸、乙酸丁酯、二甲基亞砜（DmSO）、二甲苯為分析純級，國藥控股化學(xué)藥品有限責任公司；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）、結晶紫、吖啶橙、壯觀(guān)霉素、病菌基因DnA迅速抽提檢測試劑盒、病菌總RnA迅速抽提檢測試劑盒，生工生物工程項目（上海市）股權有限責任公司；RP-c18F254S正相反薄層層析板，法國merck企業(yè)；AHLS標準物質(zhì)，英國SIgma企業(yè)。
1.2儀器設備與機器設備

SPecTramaxm5酶標儀，英國molecularDevIceS企業(yè)；LIFeEcoPcR儀，杭州市博日高新科技有限責任公司；FV300激光共聚焦光學(xué)顯微鏡，日本OLYmPUS企業(yè)；STePOne型熒光定量PcR儀，英國ABI企業(yè)；PHS-3c型數顯式酸度計，上海精科儀器設備有限責任公司；K9840全自動(dòng)凱氏定氮儀，濟南市海能儀器設備股權有限責任公司；e2695型高效率液相色譜，英國WaTerS企業(yè)；YXQ-LS-SⅡ立柱式工作壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)公司有限責任公司診療機械廠(chǎng)。

1.3 實(shí)驗方式

1.3.1 病菌產(chǎn)AHLS分子結構檢驗

參考Ravn等的方式 ，選用微生物匯報菌分析法病菌產(chǎn)AHLS分子結構的活力和類(lèi)型。

選用平行面劃線(xiàn)法剖析AHLS的發(fā)生狀況，在含1%瓊脂粉的LB平板電腦上施膠40μLX-gal（20mg/mL），將活性12h的根癌農桿菌與待測菌平行面畫(huà)線(xiàn)，于30℃中塑造24h，觀(guān)查根癌農桿菌的色澤轉變。

將待測菌細胞培養液離心式（8000×g，5mIn，4℃），上清液用相等堿化乙酸丁酯（0.5%苯甲酸）獲取2～3次，合拼有機相，旋轉蒸發(fā)器蒸干有機溶劑，用DmSO再次融解，于-20℃儲存備用。

選用平板電腦蔓延分析法AHLS活力轉變，100mL含1%瓊脂粉的LB培養基中添加4～10mL活性的根癌農桿菌和500μLX-gal（20mg/mL），混和勻稱(chēng)后竭盡平板電腦，待制冷凝結后開(kāi)洞，添加40μL待測菌AHLS萃取液，于30℃中塑造36～48h，觀(guān)查平板電腦的色澤轉變。

選用薄層色譜法（TLc）剖析病菌造成AHLS類(lèi)型，取1～10μLAHLS標準物質(zhì)與病菌AHLS提取液試品，點(diǎn)樣于c18反相薄層層析板。用層析液工業(yè)甲醇-水（容積比60/40）充足進(jìn)行，取下后在常溫狀態(tài)揮干有機溶劑。制取含根癌農桿菌的固體培養基，傾于板上，凝結后在30℃無(wú)菌檢測密閉式玻璃容器中塑造36～48h，觀(guān)查顏色轉變。AHLS標準物質(zhì)的濃度值分別為：0.1mmol/LN-丁?；?高絲氨酸內酯（c4-HSL）、10μmol/LN-己?；?高絲氨酸內酯（c6-HSL）、0.04μmol/LN-庚?；?高絲氨酸內酯（c7-HSL）、0.06μmol/LN-辛?；?高絲氨酸內酯（c8-HSL）、0.8nmol/L3-氧代-己?；?高絲氨酸內酯（oxo-c6-HSL）和1.6nmol/L3-氧代-辛?；?高絲氨酸內酯（oxo-c8-HSL）。

1.3.2 病菌的生長(cháng)曲線(xiàn)及細胞培養液PH值的測量

將活性12h的待測菌注射到100mLLB液體培養基中，在30℃下?lián)u床塑造24h，間距一定時(shí)間抽樣，參考GB/T4789.2-2008《食品衛生微生物學(xué)檢驗菌落總數測定》記數，與此同時(shí)運用酸度計測量細胞培養液PH值的轉變。

1.3.3 遺傳基因剖析

選用PcR技術(shù)指標分析病菌的luxRI同源基因、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶遺傳基因（ODC）、磷酸氫鈣脫羧酶遺傳基因（LDC）、微絨毛遺傳基因（flA）、延展性胰蛋白酶（AhyB）、絲氨酸胰蛋白酶遺傳基因（ser）、淀粉酶遺傳基因（liP）。將病菌留宿活性，運用病菌DnA獲取檢測試劑盒獲取病菌DnA模版，應用的引物設計見(jiàn)表1。50μL反映管理體系，PcR增加程序流程為：預轉性95℃3mIn，轉性95℃30S，淬火55℃1mIn，拓寬72℃1mIn（35個(gè)循環(huán)系統），終拓寬72℃10mIn。在其中，增加AhyB和flA遺傳基因時(shí)退火工藝為59℃。將擴增到的基因片段開(kāi)展1%瓊脂糖電泳電泳原理，在紫外線(xiàn)下顯像，與此同時(shí)送到生工生物工程項目有限責任公司轉錄組測序。將獲得的隊列開(kāi)展BLAST檢索和開(kāi)放閱讀框剖析。

1.3.4 大蒜提取物的制取

參考RaSmuSSen等的辦法制取大蒜提取物。將市面上蒜頭削皮，稱(chēng)量150g于300mL二甲苯中勻漿，提純12h完用WhaTman1號過(guò)濾紙過(guò)慮。向滲瀝液中添加150mL無(wú)菌水，在常溫情況下拌和24h，兩相分離得水相，經(jīng)0.22μm濾紙過(guò)慮后得1g/mL大蒜提取物。根據二倍稀釋液法明確大蒜提取物看待測菌的最少抗菌濃度值。

1.3.5 β-半乳糖酶促反應的測量

將待測菌留宿活性12h，取500μL病菌細胞培養液注射至100mLLB液體培養基中，各自添加1mL不一樣濃度值的大蒜提取物（終濃度值為0.15～1.20mg/mL），以無(wú)菌檢測鹽水為對比，于30℃搖床中震蕩塑造12h，將細胞培養液離心式（8000×g，10mIn）得上清液。參考mIller的辦法測量微生物匯報菌的β-半乳糖酶促反應。