1.3.5 反復精彩片段基因指紋剖析

以病菌基因DNA為模版，參照Silva等的方式 ，運用設計方案的BOX引物設計（引物設計編碼序列見(jiàn)表2）開(kāi)展rep-PCR擴增。待增加進(jìn)行后，將PCR物質(zhì)開(kāi)展1.5%的瓊脂糖電泳電泳原理并在UＶ燈下觀(guān)查電泳原理結果。

1.3.6 系統發(fā)育樹(shù)

將校準并拼湊后的編碼序列在GenBank中開(kāi)展同宗編碼序列的檢索，由rep-PCR獲得的大概雜帶狀況，從差別可能考慮，選用層級UPGMA法（UnweightedPair-GroupMeanAverage），依據供試菌種的rep-PCR擴增雜帶的尺寸，選用二進(jìn)制方式，轉化成系統發(fā)育樹(shù)。

1.3.7 質(zhì)粒提取

將產(chǎn)病菌素枯草芽孢菌菌種留宿塑造，運用質(zhì)粒提取檢測試劑盒（OMEGAbio-tek，上海市），依據檢測試劑盒上的講解對留宿塑造的產(chǎn)病菌素枯草芽孢菌菌種開(kāi)展質(zhì)粒提取。將獲取好的質(zhì)粒DNA在1.5%的瓊脂糖電泳下開(kāi)展電泳原理并在UＶ燈下觀(guān)查電泳原理結果。

1.3.8 病菌素粗提

1.3.8.1 硫酸銨蛋白質(zhì)變性離子交換法

按1%接種量將留宿塑造好的產(chǎn)病菌素枯草芽孢菌注射到250mL的BHI液體培養基中，放置30℃塑造最少12h。將以上留宿塑造好的菌液于4℃，10000r/min離心式標準下離心式25min，在上清液中加上45%的飽和狀態(tài)硫酸銨拌和融解，放置4℃留宿。將留宿的水溶液在10000r/min標準下離心式30min，將沉積融解于5mL聚磷酸鹽緩沖溶液PBS（pH6.86）中，即獲得病菌素粗提物。

1.3.8.2 疑膠過(guò)慮層析

以SephadexG-25為疑膠填充料，超純水系統開(kāi)展預過(guò)柱后再用PBS過(guò)柱柱頭，病菌素粗提物5mL上樣，流動(dòng)速度0.5mL/min，先應用PBS開(kāi)展過(guò)柱，以后用0.2，0.5mol/L的氧化鈉（NaCl）先后開(kāi)展過(guò)柱，搜集過(guò)柱液。各自對采集的過(guò)柱液開(kāi)展抗菌實(shí)驗（汲取2μL粗提物抑止蠟樣枯草芽孢菌），將有抗菌實(shí)際效果的過(guò)柱液開(kāi)展干凍濃縮后復溶解pH6.86的PBS中放置-20℃預留。

1.3.9 三羥甲基甘氨酸-SDS-PAGE電泳原理（Ｔricine-SDS-PAGE）

參照Schagger等的方式 ，將干凍濃縮好的病菌素粗純化化學(xué)物質(zhì)在ＴricineSDS-PAGE開(kāi)展電泳原理。在其中膠質(zhì)量濃度各自為隔層膠10%，濃縮膠4%，分離出來(lái)膠16.5%。選用分子質(zhì)量3.3～20.1ku的肽Marker（Solarbio）做為規范對比。電泳原理完畢后應用考馬斯亮藍G250開(kāi)展上色褪色，將電泳原理膠在Bio-rad顯像系統軟件下紀錄結果。

1.3.10 液相色譜儀-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用

將產(chǎn)病菌素枯草芽孢菌菌株在30℃標準下留宿塑造，將塑造好的菌液在10000r/min標準下離心式30min，取上清液加溫15min解決后，參照Sun等的方式 ，將上清液根據液相色譜儀-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用剖析蛋白質(zhì)分子品質(zhì)。運用目前蛋白組學(xué)資料庫（Omicsbean）對得到的蛋白開(kāi)展數據分析。

2 結果與探討

2.1 產(chǎn)病菌素菌種的挑選及評定

從杜蠣中基本挑選出的對普遍食源性病原菌有抗菌活力的菌種有14株（取名為O、S、18、19、26、27、4、6、4-1、F1、F2、F4、Y1、Y2）。這種病菌在板材上具備典型性的枯草芽孢菌形狀，即菌體平扁、不光滑不全透明、邊沿不齊整、微淡黃色，且革蘭氏染色后結果均呈陽(yáng)性。這14株菌對普遍病原菌的抗菌譜見(jiàn)表3。在其中O、18、19、26、27、4-1、F1、F2、F4、Y1、Y2等菌種具備廣譜性抗菌性，不但對橙黃色鏈球菌（S.aureus）、蠟樣枯草芽孢菌（Bacilluscereus）、乳酸菌（L.plantanrum）等革蘭氏陽(yáng)性菌具備不錯的抗菌實(shí)際效果，并且對弗氏檸檬酸鈉鏈球菌（C.freundii）、副血溶弧菌（V.parahemolyticus）、大腸埃希菌（E.coli）、腸胃沙門(mén)菌（S.enterica）、福氏志賀氏菌（Shigellaflexneri）等革蘭氏陽(yáng)性菌陰性菌也有著(zhù)不錯的抑制效果。此外，由表3還能夠看得出，菌種18、19、26、27具備類(lèi)似的抗菌譜，菌種F1、F2、F4、Y1、Y2等抗菌工作能力也十分相似。

將具備抗菌活力的病菌送檢驗序，其轉錄組測序結果歷經(jīng)在NCBI上開(kāi)展Blast序列比對，發(fā)覺(jué)這14株指標值菌種與枯草芽孢菌屬開(kāi)放閱讀框最大，均達到99%之上，可分析判斷其均歸屬于枯草芽孢菌屬。在其中，O為解木薯淀粉枯草芽孢菌（B.amyloliquefaciens），18、19、26、27及其F1、F2、F4、Y1和Y2等菌種均為枯草枯草芽孢菌（B.subtilis），4、6、S各自為簡(jiǎn)短枯草芽孢菌（B.pumilus）、廈門(mén)市枯草芽孢菌（B.xiamenensis）、蠟樣枯草芽孢菌（B.cereus），4-1為死谷枯草芽孢菌（B.vallismortis）。

2.2 病菌素對熱和酶的穩定性測試

病菌生長(cháng)發(fā)育歷程中形成的抗菌化學(xué)物質(zhì)除開(kāi)病菌素外，還能夠新陳代謝造成有機物、抗菌素和H2O2等其他具備抗菌活力的化學(xué)物質(zhì)。為了更好地清除其他影響要素，根據加溫解決和酶處理方法明確抗菌化學(xué)物質(zhì)為病菌素。挑選出的14株菌在升溫后維持不錯的抗菌活力。除此之外，歷經(jīng)胰蛋白酶K解決的平板電腦點(diǎn)菌處抑菌圈不詳細，這一結果表明抗菌活性物質(zhì)是耐熱性強的病菌素。

2.3 反復精彩片段基因指紋剖析（rep-PCR）和系統發(fā)育樹(shù)搭建

為了更好地明確同一屬種的病菌基因型是不是一致，本實(shí)驗根據使用獨特制定的引物設計即BOX引物設計對抗菌譜類(lèi)似且評定結果類(lèi)似的菌種的DNA開(kāi)展rep-PCR擴增，明確其對應的基因圖譜，便于進(jìn)一步對病菌開(kāi)展區別。Rep-PCR擴增物質(zhì)經(jīng)瓊脂糖電泳電泳原理后的結果如圖所示1。數據顯示，18、26、27的增加物質(zhì)基因圖譜基本一致，即反復精彩片段基本一致，能夠判斷為一種菌；F1、F2、F4、Y1、Y2等菌種的基因圖譜也展現出一致性，可分辨為同一種菌；4-1與F1、F2、F4、Y1、Y2的rep-PCR擴增物質(zhì)在＜1.0kb類(lèi)似，但在＞1.0kb處雜帶略有不同，分析判斷是同為但不一樣種的菌；O、S、4、6、4-1的雜帶不盡相同，能夠判定為同一屬種的不一樣菌。

依據rep-PCR擴增雜帶結果，選用二進(jìn)制方式，運用UPGMA手機軟件搭建獲得對應的系統發(fā)育樹(shù)（如圖2）。數據顯示菌種Y1、F4、Y2、F2、F1的開(kāi)放閱讀框較高，此外，菌種18、26、27位于一個(gè)支系簇，該結論與rep-PCR結果一致。由于rep-PCR基因指紋圖譜和系統發(fā)育樹(shù)的結果，融合枯草芽孢菌抗菌譜范疇，能夠分析判斷O、19、F和4-1與其他病菌不一樣，因而事后將采用這4株產(chǎn)病菌素枯草芽孢菌用以進(jìn)一步實(shí)驗。

2.4 質(zhì)粒提取

病菌素是根據核糖體生成發(fā)生的抗菌化學(xué)物質(zhì)。一般狀況下病菌素根據在性染色體上編號造成，還可以根據質(zhì)粒造成，也是有一些病菌素的生成是受性染色體和質(zhì)粒的雙向管控造成。為了更好地明確以上病菌素造成的部位，本實(shí)驗根據獲取質(zhì)粒中DNA，分析判斷編號病菌素的遺傳基因是不是坐落于質(zhì)粒，便于于進(jìn)一步對編號病菌素的基因序列或是結構特征給予根據。結果發(fā)覺(jué)，這4株病菌未發(fā)覺(jué)質(zhì)粒。這一結果表明這種枯草芽孢菌主要是根據性染色體上的編號遺傳基因造成病菌素。