Copines蛋白質(zhì)大家族是一類(lèi)Ca2 依靠不飽和脂肪酸融合蛋白質(zhì)，遍布普遍且演變傳統。該大家族組員結構類(lèi)型具備同樣特點(diǎn):N尾端有兩個(gè)與給定的Ca2 依靠不飽和脂肪酸融合C2結構域高寬比差不多的C2結構域;C尾端有1個(gè)與融合蛋白質(zhì)(integrin)胞外區的A結構域具備開(kāi)放閱讀框的A結構域?，F階段在哺乳類(lèi)動(dòng)物中已發(fā)覺(jué)8個(gè)該蛋白質(zhì)大家族組員，各自為Copine-1～Copine-8(遺傳基因名CPNE1～CPNE8)。

Copine-1蛋白質(zhì)是最早被發(fā)覺(jué)的。Yoo等根據小影響RNA(small interfering RNA,siRNA)敲低Copine-1基因表達可以控制人骨腫瘤體細胞的繁衍、侵蝕和轉移。研究發(fā)現，惡性腫瘤萎縮因素α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)能夠上漲內源Copine-1蛋白質(zhì)的表述，且TNF-α數據信號傳遞方式對毒蕈堿刺激性的反映伴隨著(zhù)Copine-1表述的提高而提高;Copine-1蛋白質(zhì)還能夠提高核因素κB抑止蛋白質(zhì)(inhibitor of nuclear factor kappa-B，ⅠκB)的TNF-α依賴(lài)感溶解。除此之外，Copine-1蛋白質(zhì)與p65相互影響可以清除核因素κB (nuclear factor kappa-B,NF-κB)的基因表達。Copine-6蛋白質(zhì)關(guān)鍵在神經(jīng)細胞中表述，研究表明，Copine-6蛋白質(zhì)在癲癇病腦部中的非常表述很有可能與難治性癲癇有主要聯(lián)絡(luò )。Copine-7蛋白質(zhì)是一種成神經(jīng)元細胞衍化因素，可以調整間充質(zhì)干細胞美容的成牙釉質(zhì)細胞增殖和正方向管控牙釉質(zhì)唾沫磷蛋白質(zhì)表述。Copine-8蛋白質(zhì)可能是一個(gè)抑止亞急性髓性敗血癥腫瘤細胞繁衍的因素。

Copine-3蛋白質(zhì)與Copine-1蛋白質(zhì)的氨基酸序列開(kāi)放閱讀框達到63%，其在身體的腦、肺、心血管、腎臟功能機構中都有表述。Caudell等發(fā)覺(jué)，內源Copine-3蛋白質(zhì)和外源性表述的資產(chǎn)重組Copine-3蛋白質(zhì)均可使外源性髓鞘不飽和脂肪酸偏堿蛋白質(zhì)磷酸化，殊不知，Copine-3蛋白質(zhì)氨基酸序列中缺乏已經(jīng)知道的蛋白激酶催化反應結構域，這種科學(xué)研究提醒，Copine-3蛋白質(zhì)很有可能具備自身的蛋白激酶活力。研究發(fā)現，Copine-3蛋白質(zhì)的高表述與亞急性脊髓性敗血癥的欠佳愈后相關(guān)。Tan等研究發(fā)現，與身患漫性冠脈疾患的病患對比，亞急性心肌梗塞病人的血細胞中Copine-3蛋白質(zhì)的表述量更低，說(shuō)明CPNE3遺傳基因的低表述是產(chǎn)生亞急性心梗的潛在性風(fēng)險源?？偟膩?lái)說(shuō)，Copine-3蛋白質(zhì)在人體細胞中普遍表述，但其在人體細胞中的作用尚不確立。

本科學(xué)研究運用加強型翠綠色熒光蛋白(plasmid enhanced green fluorescent protein,p EGFP)-N1搭建資產(chǎn)重組真核表達載體，脂質(zhì)體轉染人胚腎鱗狀上皮細胞293T、肺癌體細胞H1299，瞬間表述Copine-3-EGFP融合蛋白，觀(guān)查并檢驗Copine-3蛋白質(zhì)在人體細胞中的精準定位，為進(jìn)一步科學(xué)研究其分子生物學(xué)作用給予基本。

原材料和方式

1．關(guān)鍵實(shí)驗試劑和儀器設備

DMEM培養液、10%胎牛血清(FBS)、OptiMEMTMⅠ培養液購自Gibco企業(yè);107IU/L青霉素鈉 10 g/L氨芐青霉素(法抗)、0.25%蛋白酶體細胞消化酶購自索萊寶高新科技有限責任公司;LipofectamineTMLTX Reagent with PLUSTMReagent轉染實(shí)驗試劑、Pro LongTM Gold Antifade Mountant with DAPI封片狀、Copine-3抗原(兔抗人Ig G,2.63 g/L)和羅丹明標識的奶羊抗兔Ig G二抗(1.5 g/L)購自Invitrogen企業(yè);DNA分子量規范、Prime STAR HS DNA Polymerase、XhoⅠ和Bam HⅠ約束性?xún)惹忻讣捌銱igh Fidelity Prime ScriptTMRT-PCR Kit購自Ta KaRa企業(yè);總RNA獲取、質(zhì)粒提取、DNA提純檢測試劑盒及其T4連接酶購自天根生化高新科技(北京市)有限責任公司;GAPDH抗原(兔抗人Ig G,1 g/L)、β-acting抗原(兔抗人Ig G,1 g/L)購自Affinity企業(yè);Histone H1抗原(鼠抗人Ig G,200 mg/L,Santa企業(yè));HRP標識的奶羊抗兔Ig G二抗(1 g/L)和HRP標識的奶羊抗鼠Ig G二抗(1 g/L)購自Bioworld企業(yè);細胞質(zhì)蛋白質(zhì)與細胞核蛋白質(zhì)抽提檢測試劑盒、超敏ECL電化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自上海市碧云天生物技術(shù)性有限責任公司;PVDF膜(Bio-Rad公司);引物合成和DNA測序由英濰捷基上海市貿易有限責任公司進(jìn)行;GTVisionⅢ型免疫力組織化學(xué)診斷試劑盒購自遺傳基因高新科技(上海市)股權有限責任公司，肺癌組織芯片(HLug A030PG03)購自上海市芯超生物高新科技有限責任公司。

CO2細胞培養箱(Thermo企業(yè));中小型快速冷凍離心機(Eppendorf企業(yè));蛋白質(zhì)電泳儀(Bio-Rad公司);Western轉印紙儀(Hoefer企業(yè));瑩光倒置顯微鏡、激光器掃描儀共焦顯微鏡(Leica企業(yè))。

2. 實(shí)驗方法

2.1 體細胞總RNA的提煉及反轉錄:

人支氣管炎鱗狀上皮細胞(human bronchial epithelial cells,HBE)注射于6填料中，用含法抗和10?S的DMEM塑造至90%匯聚。體細胞經(jīng)0.25%蛋白酶消化吸收后，500 r/min離心式5 min搜集。按天根生化高新科技(北京市)有限責任公司總RNA獲取檢測試劑盒(DP419)使用說(shuō)明實(shí)際操作開(kāi)展體細胞總RNA的獲取。將提煉到的體細胞總RNA，按High Fidelity Primer ScriptTMRT-PCR Kit檢測試劑盒使用說(shuō)明書(shū)實(shí)際操作，反轉錄得到c DNA。

2.2 人CPNE3遺傳基因的增加:

依據CPNE3遺傳基因開(kāi)放閱讀框(精彩片段總長(cháng)1613 bp)，設計方案生成上游引物5’-A C G T C T C G A G A T G G C T G C C C A G T G T G T C A C AA-3’和中下游引物設計5’-A C G TGGATC C GC C TGC TTC TG T T G T T T C G T G G CT-3’，上、中下游引物設計各自添加X(jué)hoⅠ、Bam HⅠ酶切位點(diǎn)(下橫線(xiàn)為酶切位點(diǎn)編碼序列)。以c DNA為模板，PCR擴增CPNE3遺傳基因開(kāi)放閱讀框，反映情況為:94℃預轉性5 min,94℃轉性30 s,65℃淬火30 s,72℃拓寬2 min，循環(huán)系統30次，72℃拓寬10 min。經(jīng)1%瓊脂糖電泳電泳原理檢驗PCR物質(zhì)，膠回收利用與目地精彩片段尺寸一致的DNA雜帶。

2.3 重組質(zhì)粒p EGFP-N1-CPNE3的搭建:

將p EGFP-N1質(zhì)粒和CPNE3遺傳基因PCR物質(zhì)，各自用XhoⅠ和Bam HⅠ，在37℃下酶切1 h，膠回收利用提純酶切物質(zhì)，并且用T4 DNA連接酶16℃聯(lián)接留宿。聯(lián)接物質(zhì)轉換E.coli DH5α感受態(tài)細胞，運用卡那霉素抵抗性挑選呈陽(yáng)性集落，并抽提質(zhì)粒開(kāi)展雙酶切認證。將挑選到的呈陽(yáng)性集落送轉錄組測序。將轉錄組測序恰當的呈陽(yáng)性集落注射于含卡那霉素的LB培養基中留宿塑造，搜集菌體，按高純質(zhì)粒小提中測檢測試劑盒使用說(shuō)明書(shū)實(shí)際操作獲取質(zhì)粒，用以事后細胞轉染。

2.4 資產(chǎn)重組質(zhì)粒轉染體細胞:

293T和H1299體細胞基本塑造于含法抗和10?S的DMEM培養液，消化吸收并注射6填料。待細胞生長(cháng)至60%匯聚時(shí)，按LipofectamineLTX with PlusTMReagent轉染表明，開(kāi)展p EGFP-N1質(zhì)粒和p EGFP-N1-CPNE3重組質(zhì)粒的轉染。

2.5 細胞爬片:

293T和H1299體細胞基本塑造于含法抗和10?S的DMEM培養液，消化吸收并注射于掛有細胞爬片的24填料中。待細胞生長(cháng)至60%匯聚時(shí)，按LTX with PlusTMReagent轉染表明，開(kāi)展p EGFP-N1-CPNE3重組質(zhì)粒的轉染，對照實(shí)驗為p EGFP-N1質(zhì)粒。

2.6 激光器掃描儀共焦檢驗:

在2.5中細胞轉染48 h后，吸除細胞培養液，用PBS清理2次，添加4%多聚甲醛固定不動(dòng)10 min,0.2%Triton-100透化10 min。10%羊血清蛋白室內溫度封閉式1 h。GAPDH抗原用2%羊血清蛋白按1∶100稀釋液，滴邊加個(gè)爬片上，4℃孵育留宿。PBST浸洗爬片3次，每一次5 min。羅丹明標識的瑩光二抗(1∶100)室內溫度遮光孵育2 h,PBST浸洗3次。在蓋玻片上滴加含DAPI的封片狀，將爬片反扣在封片狀上，用中性化環(huán)氧樹(shù)脂在爬片四周進(jìn)行封固。挑選405nm激起光檢驗DAPI,488 nm激起光檢驗EGFP和Copine-3-EGFP融合蛋白，552 nm激起光檢驗GAPDH。在激光器掃描儀共焦顯微鏡下觀(guān)查并線(xiàn)片。

2.7亞體細胞組分離出來(lái):

在2.4中細胞轉染48 h后，用PBS清理2次，0.25%蛋白酶消化吸收并離心式搜集體細胞。應用上海市碧云天生物技術(shù)性有限責任公司的細胞質(zhì)蛋白質(zhì)與細胞核蛋白質(zhì)抽提檢測試劑盒，對體細胞亞組份開(kāi)展分離出來(lái)。流程:向搜集的體細胞中添加200μl細胞核蛋白質(zhì)抽提實(shí)驗試劑A，強烈渦流使體細胞徹底散掉，冰浴15 min。添加10μl抽提實(shí)驗試劑B，渦流攪拌5 s，冰浴1 min，再度渦流5 s。4℃，12 000 r/min離心式15 min。將上清液遷移到新的EP管內，獲得胞質(zhì)蛋白質(zhì)。向沉積中添加50μl細胞質(zhì)蛋白質(zhì)抽提實(shí)驗試劑，渦流攪拌30 s，冰浴30 min，期內每過(guò)1～2 min渦流攪拌30 s。4℃，12 000 r/min離心式15 min，遷移上清液到新的EP管內，獲得細胞質(zhì)蛋白質(zhì)。Bradford測定方法蛋白質(zhì)濃度值，用以事后Western blotting檢驗。

2.8 Western blotting檢驗:

各自取40μg胞質(zhì)蛋白質(zhì)和細胞質(zhì)蛋白質(zhì)經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離出來(lái)，100 V恒流源濕轉1 h至0.2μm PVDF膜上，5%低脂牛奶室內溫度封閉式2 h,PBST(含0.5%吐溫20的PBS溶液)洗膜3次。添加Copine-3抗原(1∶1000),4℃孵育留宿，PBST洗膜3次，每一次8 min。添加HRP標識的羊抗兔Ig G二抗(1∶3000)，室內溫度孵育1.5 h,PBST洗膜3次，每一次8 min。向PVDF膜上勻稱(chēng)滴入ECL發(fā)亮液，于暗室內顯影液。