2.2 HPLC法檢驗PQQ

本試驗最先分析了別的離子交換柱檢驗PQQ，結果發(fā)覺(jué)一般C18柱沒(méi)法使PQQ合理保存，拆換流動(dòng)性相工業(yè)甲醇和乙腈，或是是梯度方向過(guò)柱都不可以保存PQQ。此外發(fā)覺(jué)更改pH能夠使PQQ有一定的保存，但峰形較弱，且托尾比較嚴重，而且無(wú)法非常好分離出來(lái)試品發(fā)酵物中的PQQ。充分考慮PQQ正負極很大，因而選用耐100%水的COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ正相反離子交換柱來(lái)使PQQ有有效的保存。將準備好的七個(gè)不一樣含量的PQQ標準物質(zhì)（100，50，25，12.5，6.125，5，2.5 mg/L）開(kāi)展HPLC檢驗，每一個(gè)濃度值持續氣相3次，每一次氣相20 μ L。結果如圖所示1所顯示。不一樣含量的PQQ均在3.56 min上下出峰。伴隨著(zhù)PQQ濃度值的提升，峰總面積也逐步提升。因而PQQ濃度值與峰總面積呈成正比的關(guān)聯(lián)。以PQQ濃度值為橫坐標軸，色譜儀峰總面積為縱軸，制作標曲，線(xiàn)性相關(guān)為y=30.27x 7.32，R2=0.9998，表明線(xiàn)性相關(guān)優(yōu)良。選用COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ正相反離子交換柱檢驗PQQ，運作時(shí)間較短，PQQ出峰時(shí)間早，檢驗高效率。本研究創(chuàng )建的HPLC法檢驗PQQ具備優(yōu)良的可行性分析，可做為菌苗產(chǎn)PQQ的復篩方式。

2.3菌種的挑選和評定

經(jīng)光譜法初篩，從100好幾個(gè)試樣中挑選到50多枝PQQ造成菌，大部分的生產(chǎn)量在2~5 mg/L，極少數能夠做到10 mg/L上下，HPLC復篩后在其中PQQ生產(chǎn)量最大的1株為20.6 mg/L，峰圖如圖2所顯示，PQQ在3.57 min出峰，這也是沒(méi)經(jīng)提升已報導的搖瓶較高生產(chǎn)量。

該菌種的菌體在工業(yè)甲醇培養液平板電腦上為奶白色，濃稠的，邊沿齊整，直徑較小，為1~2 mm。菌細胞為球形，革蘭氏陽(yáng)性菌呈陰性，不產(chǎn)芽胞，有莢膜，無(wú)微絨毛。該菌種在以工業(yè)甲醇和甲胺為氮源的培養液中可以?xún)?yōu)良生長(cháng)發(fā)育，能運用D-葡萄糖水，綿白糖，葡萄糖和麥芽糖醇。在以氨鹽、磷酸鹽、牛肉膏、蛋白胨和酵母膏為氮源的培養液里能較好生長(cháng)發(fā)育。選用PCR技術(shù)性增加該菌種的16s rDNA 基因序列，經(jīng)上海生工轉錄組測序。根據在 NCBI網(wǎng)址中開(kāi)展開(kāi)放閱讀框編碼序列檢索及核對，從這當中選擇開(kāi)放閱讀框較高菌種的16s rDNA基因序列，以集團公司外菌苗作對比，根據MEGA手機軟件，用臨接法（Neighbor-Joining）搭建系統發(fā)育樹(shù)。結果如圖所示3所顯示，該菌種與 Methylopila henanensis strain LYBFD3-16A2的開(kāi)放閱讀框最大，為99%。綜合性菌體及菌體形狀特點(diǎn)、16s rDNA序列剖析，評定該菌種為Methylopila sp.菌種，取名為Methylopila sp.Z1。

2.4 工業(yè)甲醇成分的提升

科學(xué)研究工業(yè)甲醇的差異加上濃度值（0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%，3.5%，4%）對OD600和PQQ生產(chǎn)量的危害，結果如圖4所顯示。在0.5%~2.5%的含量范疇內，伴隨著(zhù)工業(yè)甲醇容積含量的提升 ，菌體OD600和PQQ生產(chǎn)量也慢慢提升，當工業(yè)甲醇濃度值為2.5%時(shí)，OD600和PQQ生產(chǎn)量均實(shí)現最大，再次提升工業(yè)甲醇濃度值，OD600和PQQ生產(chǎn)量均有顯著(zhù)降低。這是由于工業(yè)甲醇做為病菌生長(cháng)的唯一氮源，而且或是細菌細胞工業(yè)甲醇脫氨酶的底物，在其濃度值較低時(shí)，不能給予動(dòng)能使細胞生長(cháng)，也不能生產(chǎn)制造過(guò)多的PQQ代謝到培養液中，造成 PQQ生成高效率極低。當工業(yè)甲醇濃度值慢慢增強時(shí)，體細胞能夠使用的氮源提升，菌體OD600和PQQ生產(chǎn)量也逐步提升；當工業(yè)甲醇濃度值超出2.5%時(shí)，因為工業(yè)甲醇的毒素使體細胞損害，而且底物濃度值過(guò)高抑止工業(yè)甲醇脫氫酶的活性，造成 菌體OD600和PQQ生產(chǎn)量降低。因而，2.5%的工業(yè)甲醇容積濃度值針對菌體生長(cháng)發(fā)育和PQQ生成是最好的選擇。

3 結果

現階段PQQ的檢查辦法具體有資產(chǎn)重組酶法，氧化還原反應法，光譜法和HPLC，在其中資產(chǎn)重組酶法常用到的葡萄糖水脫氨酶獲取繁雜，提純全過(guò)程繁雜，且取得的酶活不高，不能適用很多的菌苗挑選；氧化還原反應法中使用到的鉻黑T鈦酸異丙酯氟苯四氮唑藍（NBT）易受培養液中別的成份的影響，導致呈陰性結果。光譜法實(shí)際操作簡(jiǎn)易，檢驗迅速，但也有可能遭受培養液中有著(zhù)類(lèi)似光波長(cháng)OD值的危害，但本試驗使用的是工業(yè)甲醇無(wú)機物培養液，并根據HPLC檢驗試品發(fā)覺(jué)，基本上沒(méi)有影響，因而光譜法做為PQQ造成菌的初篩是高效率有效的。本試驗還構建了新的HPLC法檢驗PQQ，選用親水性離子交換柱COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ，促使PQQ有有效的保存，而且試品運作時(shí)間較短，PQQ在3.56 min出峰，出峰時(shí)間早，現場(chǎng)采樣短，峰形無(wú)托尾，為PQQ檢驗給予一種新的改善方式。

因為PQQ的微生物生成原理沒(méi)有取得徹底詮釋?zhuān)鶕蚬こ碳夹g(shù)和新陳代謝更新改造提升PQQ的生產(chǎn)量遠小于野山菌的生產(chǎn)量，因而從自然環(huán)境中挑選具備增產(chǎn)PQQ工作能力的菌株是十分必要的。本試驗從試品中挑選到一株P(guān)QQ增產(chǎn)菌，經(jīng)評定為Methylopila sp.屬，取名為Methylopila_sp. Z1，沒(méi)經(jīng)提升的搖瓶生產(chǎn)量做到20.6 mg/L，歸屬于已報導的較高質(zhì)量。Z1菌種承受較高工業(yè)甲醇，在培養液工業(yè)甲醇濃度值為2.5%時(shí)，PQQ生產(chǎn)量達26.7 mg/L，對比于原始濃度值提升了28%。Z1是一株有增產(chǎn)PQQ發(fā)展潛力的菌種，事后發(fā)酵設備塑造和提升加工工藝將進(jìn)一步提高PQQ生產(chǎn)量。