以多巴（L-DOPA）為底物，測量色氨酸酶的活性。先將被測試品用乙醇融解，配置成濃度值為1Mg/ML的儲備液，再逐個(gè)稀釋液成不一樣含量的試品水溶液。按表2所顯示，先后精確汲取不一樣含量的試品水溶液，pH6.8的0.5MoL/L聚磷酸鹽緩沖液，0.5MMoL/LL-DOPA水溶液和0.15Mg/ML酪氨酸酶水溶液，充足攪拌，在37℃恒溫水浴鍋中孵育反映30MiN，隨后馬上測量各試管嬰兒中反映水溶液在475NM處的吸光度值。以上實(shí)驗均反復3次。依據酶反映特異性的界定，在一定的緩聚劑濃度值下，酶反映活力表明為ACTi，在沒(méi)有緩聚劑時(shí)酶反映活力表明為ACT0，則受試試品對酶的相對性抑制率（I）能夠界定為：
 

式中，ACTi—有緩聚劑時(shí)的酶反映活力；ACT₀—沒(méi)有緩聚劑時(shí)的酶反映活力；A₁，A₂，A₃，A₄—1，2，3，11號反映液的吸光度值。

1.2.7 B16黑素瘤體細胞體細胞MTT實(shí)驗

稱(chēng)量50g重絡(luò )酸固態(tài)，以100ML純凈水100℃融解（電爐加熱），迅速添加900ML濃H₂sO₄，攪拌，制冷就可以應用。MTT用PBs配置成濃度值5Mg/ML，過(guò)0.22μM水相濾紙后存于10ML無(wú)菌檢測離心管架中，于-20℃冷藏儲存。操作步驟：

1）取柚皮苷、NariNgiNDC和熊果素的標準物質(zhì)

20Mg，添加DMsO融解配出500MMoL/L的水解液，過(guò)0.22μM有機濾膜后以每管20μL散裝于無(wú)菌檢測的200μL離心管架中，于-20℃冷藏儲藏。

2）不一樣濃度值試品的配置

各自取柚皮苷、NariNgiNDC和熊果素3種化學(xué)物質(zhì)500MMoL/L的水解液各4μL，添加4ML1640基本培養液中，配出500μMoL/L的水溶液，隨后各自稀釋液到250，125，62.5μMoL/L3個(gè)濃度值。

3）96孔細胞培養板塑造體細胞

在凈化工作臺中移取5ML75T細胞培養瓶停止消化吸收后的體細胞與細胞培養液的溶液于離心管架中，800r/MiN離心式4MiN，棄上清液，移取3ML完全培養基于離心管架并攪拌細胞液，取以上1ML細胞液，加1ML完全培養基，取80μL于平板電腦電子計數器記數，用完全培養基稀釋液調節體細胞濃度值為8000個(gè)體細胞/100μL，用12安全通道移液器將細胞液攪拌，添加96孔細胞培養板，每孔添加100μL，搞好標識后將細胞培養板放進(jìn)CO2恒溫培養箱塑造24h。

4）96孔細胞培養板中添加試品

將以上96孔細胞培養板放進(jìn)CO2恒溫培養箱塑造24h，用廢水機械泵吸棄細胞培養液，每孔添加不一樣含量的試品150μL，而且每片96孔板都需要留1到2列只加基本培養液做空白試驗，搞好標識后將細胞培養板放進(jìn)CO2恒溫培養箱塑造24h。

5）B16黑素瘤細胞的MTT實(shí)驗

在超凈臺中，取PBs配出濃度值5Mg/ML的MTT水溶液，與基本培養液以容積比1∶9的比率配出MTT細胞培養液。將流程4）里加試品塑造24h后的細胞培養液用廢水機械泵吸棄，每孔添加150μLMTT細胞培養液，搞好標識后將細胞培養板放進(jìn)CO2恒溫培養箱塑造4h，吸棄MTT細胞培養液，每孔添加150μLDMsO，于酶標儀中震動(dòng)10MiN后測量光波長(cháng)490NM處的OD值值。

體細胞成活率=（A₀-Ax）/A₀×100%

式中，A₀—不用試品的空缺OD值值；Ax—加不一樣濃度值試品功效后的OD值值。

1．2.8 B16黑素瘤體細胞HoeChsT瑩光上色實(shí)驗

實(shí)際操作流程：

1）于凈化工作臺上，開(kāi)啟六填料，置殺菌蓋玻片。將體細胞懸液體加至蓋玻片上，置CO2摩爾分數為5%的恒溫箱中，37℃塑造至體細胞接觸抑制（約2h），添加2ML細胞培養液再次塑造約6h。棄培養液，用PBs洗3次，每一次5MiN。

2）用4%多聚甲醛固定不動(dòng)30MiN，PBs洗3次，每一次5MiN。

3）切成片稍脫水后在圈里滴入適當HoeChsT染色液到爬片上，室內溫度遮光孵育15MiN。

4）PBs浸洗爬片3次，每一次5MiN，從六填料內取下爬片，將有體細胞的一面封到滴加上抗熒光淬滅封片狀的玻璃片上，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)查并照相。

1.2.9 NariNgiNDC與雙孢蘑菇酪氨酸酶的分子對接

選用CheMBioDrawULTra14.0繪制化學(xué)物質(zhì)熊果素和NariNgiNDC的構造，隨后用CheMBio3DULTra14.0轉換為三維構造，用MMFF94引力場(chǎng)開(kāi)展提升。雙孢蘑菇酪氨酸酶的三維構造（PDBiD：2Y9X）從RCsB蛋白質(zhì)數據庫下載。酪氨酸酶和化學(xué)物質(zhì)均應用AuToｄoCkTooLs1.5.6轉換為PDBQT文件格式。選用AuToｄoCkviNa1.1.2開(kāi)展分子對接。酪氨酸酶活力結構域的座標設定為：CeNTer_x=-10.044，CeNTer_y=-28.706，CeNTer_z=-43.443；size_x=15，size_y=15，size_z=15。為了更好地提升測算的精確度，將主要參數exhausTiveNess設定為20。其他參數均用初始值。最終，選擇打得分最大的構像用PyMoL1.7.6開(kāi)展結果剖析。

2 結果與探討

2.1 柚皮苷、NaringinDC、NHDC及原兒茶醛對ABTS氧自由基的清理實(shí)際效果

以TroLox做為對比，以其濃度值-吸光度值制作標曲y=0.3627x 0.0661（R2=0.9943），科學(xué)研究柚皮苷、NariNgiNDC、NHDC及原兒茶醛4種試品對ABTs氧自由基消除實(shí)際效果，結果見(jiàn)圖3。4種試品對ABTs氧自由基消除實(shí)際效果以TroLox的抗氧化性摩爾質(zhì)量表明，結果見(jiàn)表3。

由表3得知，4種試品對ABTs氧自由基均有消除功效。以TroLox做為對比，4種試品的總抗氧化能力結果中，柚皮苷的TroLox抗氧化性摩爾質(zhì)量為0.1748MMoL/g，NHDC為2.9109MMoL/g，NariNgiNDC為0.6986MMoL/g，原兒茶醛為39.6103MMoL/g。4種試品對ABTs氧自由基消除工作能力先后為原兒茶醛＞NHDC＞NariNgiNDC＞柚皮苷。

2.2 柚皮苷、NaringinDC、NHDC及原兒茶醛對羥氧自由基的清理實(shí)際效果

以TroLox為對比，以其濃度值-吸光度值制作標曲y=4.0588x 0.079（R2=0.9998），科學(xué)研究柚皮苷、NariNgiNDC、NHDC及原兒茶醛4種試品對羥氧自由基消除實(shí)際效果，結果見(jiàn)圖4。4種試品對羥氧自由基消除實(shí)際效果以TroLox的抗氧化性摩爾質(zhì)量表明，結果見(jiàn)表4。

由表4可看得出，4種試品對羥氧自由基均有消除功效，實(shí)驗中以TroLox做為對比，獲得柚皮苷消除工作能力的TroLox摩爾質(zhì)量為19.8μMoL/g，NariNgiNDC為31.9μMoL/g，NHDC為44.4μMoL/g，原兒茶醛為365.5μMoL/g。4種試品消除羥氧自由基工作能力先后為原兒茶醛＞NHDC＞NariNgiNDC＞柚皮苷。