目的：為豬場(chǎng)實(shí)驗室提供科學(xué)的非洲豬瘟病毒核酸診斷試劑盒選擇方案。方法：選擇4種非洲豬瘟核酸檢測試劑盒，通過(guò)對比梯度稀釋后標準物質(zhì)的線(xiàn)性擴增、對低含量時(shí)（20copies/μL）的敏感性、對以純水為樣本時(shí)假陽(yáng)性檢出率。結果：線(xiàn)性擴增試驗中，A試劑盒對20copies/μL濃度的標準品檢測率為100%(3/3)，其他試劑盒對該濃度下的標準品，均未達到100%；低含量敏感性試驗中，A試劑盒陽(yáng)性檢出率為91.67%(44/48)，其他廠(chǎng)家試劑盒的檢出率分別為85.42%(41/48)、79.17%(38/48)、58.33%(28/48)；假陽(yáng)性試驗中，A和B未出現陽(yáng)性反應，而C、D試劑盒分別出現2、1個(gè)非特異性反應。結論：經(jīng)過(guò)性能比較，A試劑盒更符合豬場(chǎng)實(shí)驗室對于高敏感性和低假陽(yáng)性的要求。

非洲豬瘟病毒（AfricanSwinefevervirus，ASFV）是一類(lèi)古老的病毒，早在1921年在非洲肯尼亞首次發(fā)現，至今有約100年的歷史。非洲豬瘟（Africanswinefever，ASF）即是由非洲豬瘟病毒引起的家豬、野豬的一種急性、熱性、高度接觸性動(dòng)物傳染病，所有品種和年齡的豬均可感染，發(fā)病率和死亡率高，可達100%。世界動(dòng)物衛生組織將其列為法定報告動(dòng)物疫病，中國也將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病。ASF最早于1921年在非洲肯尼亞被發(fā)現，1957年傳入歐洲，1971年傳入加勒比海地區和南美洲，2007年傳入高加索地區，現仍在非洲、南撒丁島和高加索地區流行，給世界各國的養豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。2018年8月3日，中國確診首例非洲豬瘟疫情，之后不斷蔓延，2020年4月19日，海南報道非洲豬瘟疫情后，我國內地31個(gè)省份，已全部發(fā)現非洲豬瘟疫情。

目前尚無(wú)有效的疫苗對非洲豬瘟進(jìn)行防控，各地養殖場(chǎng)需依賴(lài)生物安全措施，并組建快速診斷實(shí)驗室，使用高精準的檢測方法，對進(jìn)出入豬場(chǎng)物質(zhì)進(jìn)行監測。該研究旨在通過(guò)比對不同廠(chǎng)家的非洲豬瘟核酸診斷試劑盒的主要性能，為豬場(chǎng)實(shí)驗室提供科學(xué)的試劑盒選擇方案，幫助豬場(chǎng)合理選擇試劑盒，構筑穩固的生物安全檢測防線(xiàn)，阻擊非洲豬瘟的入侵。

1材料與方法

1.1試劑盒與標準物質(zhì)

4種商品化的非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測試劑盒，A廠(chǎng)家試劑盒（非預混型）批次342020005，B廠(chǎng)家試劑盒（非預混型）批次202006，C廠(chǎng)家試劑盒（預混型）批次20191118，D廠(chǎng)家試劑盒（預混型）批次20200301;B646L基因標準品GBW(E)091034（批號：2020001）購自中國牧工商集團有限公司。

1.2試驗儀器

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀SLAN-48P購自上海宏石醫療科技有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1線(xiàn)性擴增試驗

將B646L基因標準品稀釋至1000copies/μL、100copies/μL、20copies/μL、4copies/μL、0.8copies/μL，共5個(gè)稀釋度，使用4種試劑盒，按照其說(shuō)明書(shū)配置PCR體系，進(jìn)行熒光PCR檢測，每個(gè)稀釋度重復3次，同時(shí)設置陰陽(yáng)性對照。分析各試劑盒對不同梯度核酸檢測Ct值，比較不同試劑盒對各稀釋度的檢出率和變異系數。

1.3.2敏感性試驗

將B646L基因標準品稀釋至20copies/μL，使用4種試劑盒對稀釋后的標準品進(jìn)行熒光PCR擴增，每種試劑盒重復檢測48個(gè)孔，統計該拷貝數下不同試劑盒的檢出率。

1.3.3假陽(yáng)性檢測試驗

使用純化水做無(wú)模板陰性對照，每種試劑盒配置46個(gè)陰性反應，設置陰陽(yáng)性對照。統計不同試劑盒出現假陽(yáng)性的次數，假陽(yáng)性概率最低者為佳。

2結果與分析

2.1線(xiàn)性擴增結果

使用4種試劑盒對稀釋后的標準品進(jìn)行檢測時(shí)，4種試劑盒在1000copies/μL、100copies/μL兩種拷貝數的檢出率均為100%，在拷貝數稀釋至20copies/μL時(shí)出現檢出率的差異：A試劑盒的檢出率為100%(3/3)，B試劑：檢出率為33.33%(1/3)，C試劑盒的檢出率為33.33%(1/3)，D試劑盒的檢出率為66.67%(2/3）。A試劑盒在20copies/μL的檢出率高于其他試劑盒，具體結果見(jiàn)表1與表2。

2.2敏感性試驗結果

使用4種試劑盒對稀釋至20copies/μL的標準品進(jìn)行檢測，結果顯示A試劑盒的檢出率最高為91.67%(44/48)，B試劑盒的檢出率次之為85.42%(41/48)，C試劑盒的檢出率為79.17%(38/48)，D試劑盒的檢出率為58.33%(28/48），具體結果見(jiàn)圖1與表3。

2.3假陽(yáng)性檢測試驗結果

使用純水做無(wú)模板陰性，每種試劑盒配置46個(gè)陰性反應，設置陰陽(yáng)性對照，統計不同試劑盒出現假陽(yáng)性（有Ct值且曲線(xiàn)不典型）的次數，A試劑盒未檢到陽(yáng)性，B試劑盒未檢測到陽(yáng)性，C試劑盒檢測2個(gè)非特異性陽(yáng)性反應，D試劑盒檢測到1個(gè)非特異性陽(yáng)性反應，具體結果見(jiàn)圖2與表4。

3討論

該研究比較了4個(gè)廠(chǎng)家生產(chǎn)的非洲豬瘟核酸診斷試劑盒對B646L基因標準品的檢測結果，結果顯示：線(xiàn)性擴增試驗中，A試劑盒對20copies/μL濃度的標準品檢出率為100%(3/3），其他試劑盒對該濃度下的標準品的檢出率均未達到100%；敏感性試驗中，A試劑盒對稀釋至20copies/μL的48個(gè)重復，檢出率為91.67%(44/48），其他試劑盒的檢出率分別為85.42%(41/48）、79.17%(38/48）、58.33%(28/48）；假陽(yáng)性試驗中，A試劑盒和B試劑盒，未出現陽(yáng)性反應，C、D試劑盒分別出現2、1個(gè)非特異陽(yáng)性反應。綜合3個(gè)試驗的結果，A試劑盒在不同稀釋濃度下的檢出率、低濃度（20copies/μL）的檢出率、假陽(yáng)性出現頻次上領(lǐng)先其他試劑盒，更符合豬場(chǎng)實(shí)驗室對于高敏感性和低假陽(yáng)性的需求，可以應用于豬場(chǎng)實(shí)驗室非洲豬瘟病毒的核酸診斷。

非洲豬瘟病毒對腐敗、溫度、干燥及消毒劑都具有較強的抵抗力。在適宜的蛋白質(zhì)環(huán)境下，非洲豬瘟病毒可在較大的溫度范圍和pH范圍內存活，在血液、尿、糞中非常穩定，能長(cháng)時(shí)間存活于經(jīng)加工過(guò)的豬肉制品中。由于A(yíng)SFV在環(huán)境中穩定、存活時(shí)間長(cháng)，生物安全是防控該病毒的唯一方案，進(jìn)入豬場(chǎng)的物質(zhì)和人員必須進(jìn)行執行嚴格的生物安全洗消，并進(jìn)行核酸檢測。選擇一款敏感性高、假陽(yáng)性少的試劑盒，能大大提升豬場(chǎng)生物安全牢固程度。

試劑盒的敏感性較低，可能與引物和探針序列、試劑盒生產(chǎn)工藝相關(guān)。在臨床檢測過(guò)程中，檢出率偏低除與試劑盒敏感性有關(guān)外，還可能與樣本復雜程度、樣本采集運輸、樣本核酸提取等各種因素相關(guān)；實(shí)驗室出現假陽(yáng)性，可能與試劑盒不穩定、實(shí)驗室污染、設備的閾值線(xiàn)設定等方面相關(guān)，豬場(chǎng)實(shí)驗室需要綜合各方面的因素進(jìn)行判斷，該研究中C、D試劑盒為預混裝，產(chǎn)生的假陽(yáng)性可能與試劑預混后，發(fā)生非特異性反應有關(guān)。

該研究?jì)H對4個(gè)廠(chǎng)家試劑某一批號的檢測能力做了簡(jiǎn)要比較分析，樣本量有限，并不能代表各試劑的整體檢測性能，僅作為一種試劑盒比對方案，供豬場(chǎng)實(shí)驗室參考，實(shí)驗室檢測能力除與試劑盒相關(guān)性能相關(guān)外，還需要實(shí)驗室的操作人員嚴格遵循標準操作流程，執行嚴格的質(zhì)量控制，避免因操作原因引起的假陰性和假陽(yáng)性結果。