2結果與分析

2.1胞壁肽HPLC分析

肽聚糖是由N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）、N-乙酰胞壁酸（MurNAc）及肽單元組成的聚合體，肽鏈氨基酸的組成主要是Ala、Glu、DAP，還有極少量的Gly，大多數G-及產(chǎn)孢菌具有meso-DAP殘基。對枯草芽孢桿菌細胞壁的肽聚糖采用變溶菌素酶解，其片段經(jīng)硼氫化鈉還原后，采用HPLC進(jìn)行胞壁肽的分離，得到胞壁肽譜圖（圖1）。從圖中可以看出，枯草芽孢桿菌的胞壁肽主要含有15個(gè)胞壁肽組分，主要的峰8個(gè)。肽聚糖經(jīng)過(guò)變溶菌素酶解后，形成以GlcNAc-MurNAc-L-Ala-D-Glu-mesoDAP為基本結構單元的二聚體、三聚體、四聚體等。這些胞壁肽組分分子質(zhì)量越大，保留時(shí)間越長(cháng)，因此，單體目標峰出峰時(shí)間較早。Atrih等對枯草芽孢桿菌的胞壁肽進(jìn)行分析，得到38個(gè)組分，在20min保留時(shí)間內的前4個(gè)組分均為胞壁肽單體，個(gè)別組分基團出現酰胺化而保留時(shí)間不同。此結果也與文獻報道相一致。
 

2.2胞壁肽ESl-MS分析

對每個(gè)組分單峰收集，脫鹽后進(jìn)行ESI-MS分析，通過(guò)對3號峰的MS分析（圖2），其分子離子[M]⁺為m/z869，伴峰：[M+H]⁺為m/z870，該分子質(zhì)量組成與GlcNAc-MurNAc-L-Ala-D-Glu-mesoDAP（理論值：869.9）一致，伴峰的形成是因為在正離子模式下，目的片段會(huì )在電離過(guò)程中加一個(gè)氫，分子質(zhì)量增加。因此，峰3即為目標物二糖三肽（GM-ＴriDAP），其結構示意圖如圖2所示。

2.3胞壁肽FTlR

對胞壁肽3號峰單峰收集，冷凍干燥后進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜分析，紅外光譜圖見(jiàn)圖3所示，從圖中可以看出，在2個(gè)區域存在強吸收，一個(gè)是～3447cm^-1，另一個(gè)是～1020cm^-1。肽鏈的幾個(gè)特征帶包括酰胺A帶（～3500cm^-1）、酰胺Ⅰ帶（1600～1700cm^-1）和酰胺Ⅱ帶（1510～1580cm^-1）。酰胺A帶主要是N-H伸縮振動(dòng)，對氫鍵非常敏感；酰胺Ⅰ帶是肽鏈的主要特征帶，主要是C=O和C-N的伸縮振動(dòng)；而酰胺Ⅱ帶主要是N-H面內變角振動(dòng)，以及C-N和C-C的伸縮振動(dòng)。糖環(huán)的特征峰集中在800cm^-1～1200cm^-1之間，包括C-OH的伸縮振動(dòng)和糖苷鍵C-O-C的振動(dòng)疊加吸收信號。峰3的紅外光譜的吸收峰歸類(lèi)見(jiàn)表1所示，從表中可以看出，胞壁肽3號峰包涵糖肽的典型基團振動(dòng)特征，一個(gè)是肽鏈的酰胺吸收帶，包括3447cm^-1的酰胺A帶、1647cm^-1的酰胺Ⅰ帶；另一個(gè)是在1200～800cm^-1，1020cm^-1是糖環(huán)以及糖苷鍵的特征吸收峰。因此，胞壁肽3號峰具有典型的糖肽結構特征。
 

2.41HNMR

氫譜是所有核磁共振譜中靈敏度最高的，可以為化合物提供豐富的結構信息。對胞壁肽3號峰的結構進(jìn)行氫譜分析，檢驗其是否與GlcNAcMurNAc-L-Ala-D-Glu-mesoDAP結構相符。氫譜中各官能團的化學(xué)特性主要體現在化學(xué)位移上，氫原子核外電子云密度越大，化學(xué)位移越小，出峰位置越靠近右方。1HNMR譜見(jiàn)圖4所示，從圖中可以看到典型的胞壁肽信號模式，糖肽官能團本身的性質(zhì)、取代基等都會(huì )對物質(zhì)的化學(xué)位移產(chǎn)生影響，從而改變官能團出峰位置，糖環(huán)和肽鏈表現不同的化學(xué)位移。在前人針對肽聚糖片段核磁分析的基礎上，對胞壁肽3號峰氫譜的化學(xué)位移進(jìn)行歸屬，GlcNAc、MurNAc和肽鏈氨基殘基的典型信號介于4.7×10^-6～3.3×10^-6之間，4.67是GlcNAc異頭碳原子上的質(zhì)子共振信號；對于甲基和脂肪烴的亞甲基質(zhì)子化學(xué)位移介于2.5×10^-6～1.1×10^-6之間。綜合上述分析，胞壁肽峰3的1HNMR與目標糖肽結構相符。

2.5胞壁肽對芽孢萌發(fā)的影響

芽孢萌發(fā)后熱抗性消失，濕熱處理（80℃，20min）不能直接殺滅芽孢，但可將萌發(fā)的芽孢殺滅。因此，熱抗性消失經(jīng)常用來(lái)表征芽孢是否經(jīng)歷了萌發(fā)。為驗證本文中得到的胞壁肽是否具有萌發(fā)效果，將制備的胞壁肽加入到枯草芽孢桿菌168芽孢液中混合均勻（胞壁肽終質(zhì)量濃度為1mg/mL），37℃振蕩孵育1h。隨后，將胞壁肽處理后的芽孢進(jìn)行濕熱處理（80℃，20min），利用平板計數法計算濕熱處理前后芽孢數量的變化即為萌發(fā)芽孢的數量。胞壁肽對枯草芽孢桿菌168芽孢萌發(fā)的影響如圖5所示。未加入胞壁肽的處理組中，芽孢數經(jīng)濕熱處理后并未減少，說(shuō)明芽孢仍保持原有的熱抗性，并未發(fā)生萌發(fā)過(guò)程。而加入胞壁肽后的芽孢經(jīng)濕熱處理后數量減少了0.9個(gè)對數，說(shuō)明0.9個(gè)對數的芽孢在胞壁肽處理后熱抗性消失，發(fā)生了萌發(fā)，與前人研究結果相一致。由此可知，本試驗中制備的胞壁肽（二糖三肽）能誘導芽孢萌發(fā)，為后續進(jìn)一步研究胞壁肽誘導芽孢萌發(fā)機理奠定基礎。
 

3結論

利用枯草芽孢桿菌為對象，制備、分離純化細菌營(yíng)養體細胞壁上的胞壁肽，得到的胞壁肽最小單位為二糖三肽，此胞壁肽可以有效促進(jìn)芽孢萌發(fā)，為芽孢萌發(fā)的進(jìn)一步研究奠定基礎。