1.3方法

1.3.1DNA提取

采用天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組，具體方法和步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。所提取的菌株DNA利用核酸蛋白分析儀和Qubit熒光定量測定儀檢測基因組DNA的純度和濃度，并送北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行全基因組測序。

1.3.2細菌全基因組測序及生物信息學(xué)分析

經(jīng)電泳檢測合格的DNA樣品用超聲波破碎儀隨機打斷成長(cháng)度約為350bp的片段，經(jīng)末端修復、加A尾、加測序接頭、純化、PCR擴增等步驟完成文庫制備。使用Qubit2.0和Agilent2100對構建好的文庫進(jìn)行初步定量和插入片段檢測。插入片段符合預期后，使用Q-PCR對文庫的有效濃度進(jìn)行準確定量。文庫檢測合格后采用北京諾禾致源科技股份有限公司的IlluminaNovaSeq6000測序系統進(jìn)行全基因組測序。對illumina測序平臺的數據進(jìn)行低質(zhì)量過(guò)濾，包括去除無(wú)效信號、去除測序接頭和錨定引物序列、去除復雜序列和重復序列，從而獲得高質(zhì)量的有效數據（CleanData）進(jìn)行后續分析。使用SOAPdenovo軟件進(jìn)行組裝，用RAST對組裝序列進(jìn)行注釋(http://rast.nmpdr.org)。使用基因組流行病學(xué)中心（CenterforGenomicEpidemiology）CGE的默認閾值，對組裝序列進(jìn)行鑒定（http://www.genomicepidemiology.org），利用ThePathosystemsResourceIntegrationCenter（PATRIC）對基因組組成進(jìn)行分析（https://www.patricbrc.org/），利用CGEVirulenceFinder在線(xiàn)數據庫對血清分型、MLST分型和毒力基因進(jìn)行分析。

1.3.3特征性基因PCR檢測方法

將提取的CMCC44841基因組DNA定量后，分別進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)玫?0-1、10-2、10-3、10-4系列濃度，參照GB4789.6-2016中引物序列和PCR檢測方法，進(jìn)行astA、aggR、pic特征性基因PCR擴增和靈敏度檢測，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.3.4標準物質(zhì)的生產(chǎn)制備

1.3.4.1EAEC菌體標準物質(zhì)的制備

取CMCC44841一代新鮮培養物，劃線(xiàn)接種于TSA平板，36℃培養24h。用無(wú)菌棉簽從平板上刮取菌落，加入到含有海藻糖和胎牛血清的凍干保護劑中，渦旋混勻，用移液槍吸取20μL在低溫下速凍成球，然后于冷凍干燥機中冷凍干燥。將凍干后的菌球置于2mL的西林瓶中，利用冷凍干燥機進(jìn)行真空壓蓋密封。最終制備成EAEC含量為103CFU/樣品的菌球。

1.3.4.2EAECgDNA標準物質(zhì)的制備

將純度A260/A280為1.7的20µgDNA加入到20ml含有葡聚糖的凍干保護劑中，用移液槍吸取20μL在低溫下速凍成球，然后于冷凍干燥機中進(jìn)行冷凍干燥，最終制備成含量為20ng/樣品的菌球。將凍干后的菌球放入2mL的西林瓶中，將膠塞虛掩的蓋在西林瓶上，然后用冷凍干燥機進(jìn)行真空壓蓋。

1.3.5標準物質(zhì)均勻性測試

1.3.5.1EAEC菌體標準物質(zhì)均勻性測試

根據標準物質(zhì)均勻性研究抽取樣品數量要求，從制備的一批600瓶標準物質(zhì)中隨機抽取20瓶樣品，每瓶樣品充分溶于1mL生理鹽水，使用螺旋涂布儀E50模式在TSA平板上進(jìn)行螺旋涂布，每個(gè)樣品2個(gè)平行。36℃培養24h后對平板進(jìn)行菌落計數。根據CNAS-GL003對計數結果進(jìn)行單因子方差分析，評價(jià)樣品的均勻性。

1.3.5.2EAECgDNA標準物質(zhì)均勻性測試

根據標準物質(zhì)均勻性研究抽取樣品數量要求，從制備的一批300瓶標準物質(zhì)中隨機抽取10件樣品，向每瓶標準物質(zhì)樣品加入100μLddH2O，充分溶解，制備成20ng/100μL濃度的DNA樣品，取2μL作為模板，參照GB4789.6-2016中引物序列和PCR檢測方法，進(jìn)行astA、aggR、pic特征性基因PCR擴增。

1.3.6標準物質(zhì)穩定性測試

1.3.6.1運輸穩定性

將制備的EAEC菌體標準物質(zhì)和gDNA標準物質(zhì)分別存放于25℃和37℃條件下，EAEC菌體標準物質(zhì)模擬實(shí)驗周期為7天，分別于1、3、5、7天抽取3個(gè)樣品，進(jìn)行含菌量測定。根據CNAS-GL003中｜-｜≤0.3σ準則對結果進(jìn)行穩定性評價(jià)。EAECgDNA標準物質(zhì)模擬實(shí)驗周期為14天，分別于1、3、5、7、14天抽取3個(gè)樣品，對特征性基因進(jìn)行PCR擴增，考察樣品的運輸穩定性。

1.3.6.2儲藏穩定性

將制備的EAEC菌體標準物質(zhì)及gDNA標準物質(zhì)分別于-20℃、4℃條件下保存2個(gè)月。于4℃保存7、14和28天，-20℃保存28和60天，分別抽取3個(gè)樣品進(jìn)行菌含量測定，于4℃和-20℃保存28、45和60天分別抽取3個(gè)樣品進(jìn)行特征性基因檢測，考察樣品的儲藏穩定性。根據CNAS-GL003中｜-｜≤0.3σ準則對EAEC標準物質(zhì)進(jìn)行穩定性評價(jià)。

1.3.7標準物質(zhì)的協(xié)作驗證

使用上述制備好的樣品，按照國家藥品標準物質(zhì)協(xié)作標定實(shí)施細則，發(fā)給3家實(shí)驗室，代碼分別為A、B和C，每家實(shí)驗室收到10件樣品，參照協(xié)作驗證作業(yè)指導書(shū)對樣品中EAEC標準物質(zhì)及其gDNA標準物質(zhì)進(jìn)行檢驗，包括菌落計數和特征性基因檢測。

1.3.8標準物質(zhì)使用效果驗證

根據GB29921-2013《食品安全國家標準食品中致病菌限量》，選擇熟肉制品、乳粉、腐乳、餅干和薯片5種食品基質(zhì)共20份樣品對EAEC標準物質(zhì)的使用效果進(jìn)行驗證，樣品信息見(jiàn)表1。先將EAEC103CFU濃度的標準物質(zhì)溶于1mL生理鹽水中，每件樣品各稱(chēng)取2份，25g/份，一份正常檢驗，一份加入標準物質(zhì)100μL，根據GB4789.6-2016進(jìn)行操作。增菌后劃線(xiàn)分離平板觀(guān)察是否有典型菌落生長(cháng)，并進(jìn)行PCR確認。