2.3 重組菌全細胞轉化制備GABA的工藝優(yōu)化

2.3.1 溫度對重組菌全細胞轉化生產(chǎn)CABA的影響

酶法制備GABA是一個(gè)不可逆反應，適宜的溫度可以使GABA轉化率達到最大，所以通過(guò)設置不同的酶轉化溫度來(lái)探究溫度對GABA轉化率的影響。以100g/L的谷氨酸為底物，溶于去離子水中，加入濕菌體(在55℃水浴鍋預處理50min，改善細胞膜的通透性)30U/g，在150r/min的水浴搖床中進(jìn)行轉化，反應過(guò)程中，控制pH為5.0。溫度梯度設置為25、30、35、40、45、50℃，反應24h后終止反應并進(jìn)行煮沸處理，12000r/min離心5min得上清液，適當稀釋并過(guò)0.22μm有機濾膜后用HPLC-OPA柱前衍生法進(jìn)行檢測，結果見(jiàn)圖9。轉化率隨溫度升高逐漸提高.當轉化溫度達到40℃時(shí)，GAD-0和GAD-PL轉化率達到最高，分別為64.78％和82.27％，繼續升高溫度，轉化率反而降低。這是因為枯草芽孢桿菌細胞壁厚，而反應溫度過(guò)低時(shí)，底物與胞內酶液無(wú)法充分接觸使得轉化率低：當反應溫度過(guò)高時(shí)，酶與PLP穩定性差，從而影響GABA的轉化率。

2.3.2 DH對重組菌全細胞轉化生產(chǎn)GABA的影響

以100g/L的谷氨酸為底物.溶于去離子水中，加入預處理過(guò)的濕菌體30U/g，在40℃、150r/min的水浴搖床巾進(jìn)行轉化，反應過(guò)程中，每隔2h用0.6mol/L的H₂S0₄或NaOH調節pH，使其始終與初始pH保持一致。pH梯度設置為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，反應24h后終止反應并進(jìn)行煮沸處理，12000r/min離心5min得上清液，適當稀釋并過(guò)0.22μm有機濾膜后用HPLC-OPA柱前衍生法進(jìn)行檢測。結果見(jiàn)圖10，當pH為4.5或5.0時(shí)，GABA轉化率最高，GAD-0的GABA轉化率為75.45％和76.21％，GAD-PL的GABA轉化率為84.54％和84.21％。當DH小于4.5時(shí)，底物-水谷氨酸鈉在酸性條件下容易酸水解生成谷氨酸析出，從而形成乳白色渾濁液體.不利于酶與底物的充分結合；當pH大于5.0時(shí)不利于酶活性巾心的賴(lài)氨酸殘基以shifft-堿與PLP、底物結合，從而抑制GABA的生成?？梢?jiàn)，酶轉化法制備GABA的pH耐受范圍窄，過(guò)酸或過(guò)堿都不利于酶促反應進(jìn)行，考慮在高質(zhì)量濃度底物下，過(guò)低的pH更容易導致底物析出，所以酶轉化最適pH為5.0。

2.3.3 加菌量對重組菌全細胞轉化生產(chǎn)GABA的影響

以100g/L的谷氨酸為底物，溶于去離子水中，加入預處理過(guò)的不同濕菌體(20、30、40、50、60U/g)，在40℃、150r/min的水浴搖床中反應24h，反應過(guò)程中，控制pH為5.0。反應結束后進(jìn)行煮沸處理，12000r/min離心5min得上清液，適當稀釋后用氨基酸柱前衍生法進(jìn)行HPLC檢測。結果見(jiàn)圖11，重組菌全細胞轉化率隨著(zhù)加菌量的增加而逐漸提高，其中GAD-PL和GAD-0分別在40U/g和50U/g時(shí)將底物完全轉化，轉化率達到100％。GAD-PL的加菌量少于GAD-0是因為前者細胞巾的PLP含量高于后者，PLP作為輔助因子有利于酶促反應的進(jìn)行。
 

2.3.4 反應時(shí)間對重組茵全細胞轉化生嚴GABA的影響

以100g/L的谷氨酸為底物，溶于去離子水中，加入預處理過(guò)的不同濕菌體，GAD-0和GAD-PL加入量分別為50U/g和40U/g，在40℃、150r/min的水浴搖床中反應24h，反應過(guò)程中，控制DH為5.0。反應結束后進(jìn)行煮沸處理，12000r/min離心5min得上清液，適當稀釋后用HPLC-OPA柱前衍生法進(jìn)行檢測，結果見(jiàn)圖12。在0～20h，GAD-0和GAD-PL轉化合成GABA的產(chǎn)量隨時(shí)問(wèn)延長(cháng)迅速增加，在20h時(shí)轉化率達到100％，之后隨著(zhù)反應進(jìn)行，轉化率不再發(fā)生變化。

2.3.5 底物質(zhì)量濃度對重組菌全細胞轉化生嚴GABA的影響

以200g/L的谷氨酸為初始底物，溶于去離子水中，加入預處理過(guò)的不同濕菌體，GAD-0和GAD-PL力口菌量分另0為50U/g和40U/g，在40℃、150r/min的水浴搖床中反應6h后，每隔3h補加1.27g的谷氨酸同體至底物質(zhì)量濃度分別為200、250、300、350、400g/L，反應過(guò)程中，控制pH為5.0，反應48h。反應結束后進(jìn)行煮沸處理，12000r/min離心5min得上清液，適當稀釋并過(guò)0.22μm有機濾膜后用HPLC-OPA柱前衍生法進(jìn)行檢測。結果見(jiàn)圖13，當底物質(zhì)量濃度達到400g/L谷氨酸時(shí)，GAD-0和GAD-PL轉化生產(chǎn)GABA的轉化率分別從100％(底物質(zhì)量濃度350g/L谷氨酸)下降為97.72％和98.43％。綜合考慮，為提高工業(yè)生產(chǎn)效率和節省下游分離純化成本，選擇350g/L作為酶法制備GABA的最適底物質(zhì)量濃度。

3 結語(yǔ)

作者成功構建并重組表達了含有Escherichiacoli來(lái)源的gadB基因的重組菌B.subtilis/pHY300PLK-gadB。實(shí)驗表明在發(fā)酵過(guò)程中添加0.5mmol/L輔酶前體PL的GAD總酶活達到28.14U/mL，是對照總酶活的1.72倍。進(jìn)一步優(yōu)化重組菌全細胞酶法生產(chǎn)GABA的工藝條件，結果表明，當溫度為40℃，pH為5.0，GAD-0和GAD-PL的最適加菌量分別為50U/g和40U/g時(shí)，GABA轉化率達到100％。當谷氨酸質(zhì)量濃度為400g/L時(shí)，GABA產(chǎn)量分別為275.60扎和273.61g/L。綜上所述，作者考察了菌體發(fā)酵培養過(guò)程中添加輔酶前體PL對重組菌產(chǎn)GAD及制備GABA的影響，開(kāi)發(fā)了一種不需要在發(fā)酵過(guò)程和酶轉化體系巾添加昂貴輔酶PLP就能高效生產(chǎn)GABA的T藝技術(shù)，為GABA在食品和醫藥行業(yè)中的廣泛應用打下了堅實(shí)基礎。