中藥橘紅為蕓香科植物橘Citrus.reticulate.Blanco及其栽培變種的外層果皮,性溫,味辛、苦,歸肺、脾經(jīng)。具有理氣健脾、燥濕化痰的功效,用以治療脾胃氣滯引起的胸膈脹滿(mǎn)、食積傷酒及痰濕壅肺的胸膈滿(mǎn)悶、喘滿(mǎn)痰多等癥。文獻關(guān)于橘紅的化學(xué)成分報道較少,主要有揮發(fā)油和黃酮,具有多種藥理作用,如橘紅素具有抗腫瘤、抗炎、抗哮喘、神經(jīng)保護等作用。
研究中藥橘紅的抗氧化活性,首先比較了十二個(gè)提取物樣品在同濃度下清除2.2-二苯基-1-苦基肼自由基(DPPH)作用、金屬離子螯合能力和對黃嘌呤氧化酶的抑制作用,以確定效果較好的樣品和抗氧化模型;然后將活性較好的樣品采用制備薄層層析法進(jìn)一步分離,比較所得樣品對較適宜抗氧化模型的作用;最后初步確定活性較好的樣品結構類(lèi)型。實(shí)驗結果表明乙酸乙酯提取物所分的兩個(gè)部分和無(wú)水乙醇提取物所分的兩個(gè)部分對DPPH自由基清除作用相對較強;經(jīng)制備薄層層析法進(jìn)一步得到的二個(gè)黃酮類(lèi)樣品清除DPPH自由基作用與濃度呈較好的量效關(guān)系。
機體內的氧化損傷會(huì )導致許多疾病的產(chǎn)生,如心血管疾病、白內障、關(guān)節炎和癌癥等,而抗氧化劑是一類(lèi)能夠延緩、阻止或消除氧化損傷的物質(zhì),按其來(lái)源可分為人工合成抗氧化劑和天然抗氧化劑。其中天然抗氧化劑因其安全高效性而受到人們的喜愛(ài),是當前抗氧化劑研究中的熱點(diǎn)領(lǐng)域。中草藥是天然抗氧化劑的重要來(lái)源,學(xué)者認為某些中草藥的療效與其抗氧化作用密切相關(guān),從中草藥中開(kāi)發(fā)高效抗氧化劑對食品工業(yè)、醫藥、營(yíng)養學(xué)均有重要意義??寡趸饔脵C理可以是直接作用在自由基或是間接消耗掉容易生成自由基的物質(zhì),防止發(fā)生進(jìn)一步反應,包括鰲合金屬離子、清除自由基、淬滅單線(xiàn)態(tài)氧、清除氧、抑制氧化酶活性等。
為了研究橘紅中的抗氧化作用成分,本實(shí)驗首先將橘紅干燥、粉碎后過(guò)100目篩,用石油醚Ⅱ、氯仿、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、甲醇和蒸餾水依次對其進(jìn)行回流提取,每種提取物再根據是否溶于無(wú)水乙醇或其溶液分為二個(gè)部分,共得到十二個(gè)部分,研究它們在同濃度下對不同抗氧化模型的作用,包括清除2.2-二苯基-1-苦基肼自由基作用、金屬離子螯合能力和對黃嘌呤氧化酶的抑制作用,以確定活性較好的部位和作用模型;然后將活性部位采用制備薄層層析法進(jìn)一步分離,測定所得樣品對較好作用模型的抗氧化活性,篩選出活性較好的樣品并采用物化數據、顏色反應初步確定其結構類(lèi)型,以期為其作為天然抗氧化劑提供理論參考。
DGG-9070AD電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實(shí)驗儀器有限公司);XL-30C超微粉碎機(廣州市旭朗機械設備有限公司);JA2603B電子天平(上海精制天美科學(xué)儀器有限公司);DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州予華儀器制造有限公司);N-1300旋轉蒸發(fā)儀(上海愛(ài)朗儀器有限公司);SB-1300水浴鍋(上海愛(ài)朗儀器有限公司);SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵(上海邦西儀器科技有限公司);TDL-40低速臺式大容量離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng));ZF-1三用紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司);UV-3100PC紫外可見(jiàn)分光光度計(上海美普達儀器有限公司)。
橘紅(購自浙江省金華市磐安藥市);2.2-二苯基-1-苦味?;杂苫?DPPH)、氯化亞鐵、黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶、菲啰嗪?jiǎn)吴c鹽(上海晶純生化科技股份有限公司);羧甲基纖維素鈉(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);GF254薄層層析用硅膠(青島海洋化工有限公司);石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、無(wú)水乙醇、乙二胺四乙酸、碳酸鈉、氫氧化鈉(分析純,廣州化學(xué)試劑廠(chǎng));二甲基亞砜(天津市廣成化學(xué)試劑有限公司)。
稱(chēng)取50.00g橘紅粉末,用500mL石油醚回流提取1h,提取2次,合并提取液,減壓蒸餾去除溶劑,得到石油醚提取物(1),加入15mL無(wú)水乙醇搖勻,4000r/min離心10分鐘,得到溶解部分(1a)和沉淀部分(1b)。同法,氯仿提取物分為醇溶解部分(2a)和沉淀部分(2b);乙酸乙酯提取物分為醇溶解部分(3a)和沉淀部分(3b);無(wú)水乙醇提取物分為醇溶解部分(4a)和沉淀部分(4b);甲醇提取物分為甲醇/無(wú)水乙醇=1︰1溶解部分(5a)和沉淀部分(5b);蒸餾水提取物分為無(wú)水乙醇/水=1︰1溶解部分(6a)和沉淀部分(6b)。觀(guān)察各部分顏色外觀(guān),稱(chēng)重并計算得率。
將上述各部分樣品分別用二甲亞砜配制為1.00mg/mL待測液。以抗壞血酸(Vc)為對照,參考文獻方法清除DPPH自由基;參考范金波等的實(shí)驗方法測定各樣品溶液與金屬離子(Fe2+)的螯合能力;參考郭少英等的實(shí)驗方法,測定各樣品溶液對黃嘌呤氧化酶(XOD)的抑制作用。
將1.2.1實(shí)驗結果較顯著(zhù)的提取物部分用甲醇溶解,采用制備薄層層析法(PTLC)分離,紫外反射儀上觀(guān)察,將比較明顯的斑點(diǎn)刮下溶解后過(guò)濾,濾液室溫晾干后烘箱干燥,觀(guān)察顏色外觀(guān)、稱(chēng)重并計算得率。
各樣品均用二甲亞砜配制成1.00mg/mL待測液,按照1.2.1實(shí)驗部分測定它們對較好抗氧化實(shí)驗模型的作用。將活性效果較好的樣品配制成不同濃度,測試濃度與清除率的對應關(guān)系。
通過(guò)理化性質(zhì)和顯色反應初步確定活性較好的樣品的化學(xué)結構類(lèi)型。
活性實(shí)驗重復3次,實(shí)驗結果均表示為平均值。采用MicrosoftOfficeExcel2007軟件進(jìn)行數據處理。
橘紅粉末依次用石油醚Ⅱ、氯仿、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、甲醇和蒸餾水提取,所得各提取物再根據在無(wú)水乙醇或其50%乙醇溶液中的溶解性分為兩個(gè)部分,共得到十二個(gè)樣品,其理化性質(zhì)見(jiàn)表1。從中可以看出得率大小為:4a>6b>5b>5a>4b>6a>3b>1b>1a>2b>3a>2a,其中6a和6b部分顏色較深,其它提取物部分顏色相對較淺。