時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)(time-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)是依賴(lài)于稀土元素獨特的熒光性質(zhì)而發(fā)展起來(lái)的一種免疫檢測技術(shù)，它集合了放射免疫技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)以及普通熒光免疫技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有靈敏度高、特異性強、穩定性好，且線(xiàn)性范圍寬，熒光壽命長(cháng)，操作簡(jiǎn)單和非放射性等特點(diǎn)，在免疫分析領(lǐng)域展現了良好的應用前景。圍繞時(shí)間分辨熒光在免疫分析中的最新研究進(jìn)展，介紹了幾種常見(jiàn)的用于TRFIA的材料，闡述了TRFIA在免疫診斷、食品檢測、環(huán)境監測等方面的應用，并對其發(fā)展方向和應用前景進(jìn)行了展望。

時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)(time-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)是將時(shí)間分辨熒光與免疫分析技術(shù)相結合，依賴(lài)于稀土元素熒光壽命長(cháng)、Stokes位移大、發(fā)射光譜信號峰尖銳等獨特的熒光性質(zhì)而發(fā)展起來(lái)的一種檢測技術(shù)，其基本過(guò)程是首先利用稀土元素標記抗原或抗體，在一定的體系中與待測物反應形成免疫復合物；然后通過(guò)設定適當的延遲時(shí)間和門(mén)控時(shí)間，脈沖激發(fā)待測產(chǎn)物，短壽命的背景熒光信號(納秒級別內)會(huì )在延遲時(shí)間內衰減消失，再對熒光信號進(jìn)行采集，得到長(cháng)熒光壽命的信號信息；最后根據相對熒光強度對待測物進(jìn)行定量分析。該方法能夠消除本底短壽命熒光的干擾，提高了檢測信噪比，與傳統的熒光檢測技術(shù)相比，明顯提高了熒光檢測結果的靈敏度和準確度。

研究從TRFIA的材料和應用兩個(gè)方面對其進(jìn)行闡述，列舉了幾種常見(jiàn)的用于TRFIA的材料及其制備方法的改進(jìn)，并且對TRFIA在免疫診斷、食品檢測、環(huán)境監測等領(lǐng)域的應用進(jìn)行了介紹。

1用于TRFIA的材料

1.1稀土螯合物

稀土離子本身的發(fā)光效率較低，引入適當的有機配體與稀土離子配位，利用分子內的能量轉移，敏化中心離子發(fā)光，可以有效增強稀土離子的熒光性質(zhì)。選擇合適的功能基團和設計適當的配體，使得稀土元素與抗原抗體形成穩定的熒光復合物，可以用于時(shí)間分辨熒光免疫分析。常用的稀土螯合劑主要包括多氨基羧酸類(lèi)、β-二酮類(lèi)、菲啰啉類(lèi)、水楊酸類(lèi)以及聯(lián)吡啶類(lèi)螯合劑。

多氨基羧酸類(lèi)螯合劑包括乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺四乙酸(DTTA)和二乙三胺五乙酸(DTPA),主要用于解離-增強鑭系熒光免疫分析系統(DELFIA)。此類(lèi)螯合劑與稀土離子螯合的能力很強，具有穩定性好、在酸性增強液中稀土離子解離快的優(yōu)點(diǎn)，這樣有利于提高分析方法的靈敏度。

β-二酮類(lèi)螯合劑包括β-NTA、2-噻吩甲?；?TTA)和三甲基乙酰三氟丙酮(PTA),它們能與稀土離子形成熒光很強的配合物，但是這些二齒配位體上沒(méi)有可與抗原(抗體)結合的功能性取代基，并且形成的配合物穩定性較差，不能直接作為標記物進(jìn)行時(shí)間分辨熒光分析。因此，有課題組設計合成一種氯磺?；乃凝Xβ-二酮，用作稀土離子螯合劑。

此外，4,7-二(氯磺?；交?-1,10-菲啰啉-2,9-二羧酸(BCPDA)是典型的菲啰啉衍生物，主要用于CyberFluoro體系，它的特點(diǎn)是可以與Eu3+配位發(fā)出長(cháng)壽命的熒光，無(wú)需加入熒光增強溶液便可直接測定熒光強度，但是BCPDA-Eu3+在時(shí)間分辨熒光免疫分析中存在靈敏度較低的缺點(diǎn)，通過(guò)引入生物素-鏈霉親和素系統(BAS),使得檢測靈敏度得到顯著(zhù)提高。

1.2稀土摻雜納米材料

隨著(zhù)納米材料和納米技術(shù)在醫學(xué)、生物傳感、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域的迅速發(fā)展，稀土離子摻雜的納米顆粒作為一種光致發(fā)光納米材料，以其獨特的熒光性能引起了人們的普遍關(guān)注。稀土摻雜的納米晶體在熒光性能優(yōu)越和熒光壽命長(cháng)的基礎上，具有量子產(chǎn)率高、結構穩定等優(yōu)點(diǎn)，代替稀土螯合物材料成為新一代熒光納米探針。

目前，用于制備稀土摻雜納米顆粒的方法主要包括水(溶劑)熱合成法、熱分解法、共沉淀法等。絕大部分方法是在親油性表面活性劑以及其它高沸點(diǎn)的有機溶劑中制備稀土摻雜納米顆粒的，這將有利于合成尺寸分布范圍窄、結晶程度好、核殼結構明確、光學(xué)性能優(yōu)異的高質(zhì)量納米顆粒，但該種材料疏水性，不易與生物體系相容。為了使其適用于生物醫學(xué)領(lǐng)域，需要對納米粒子進(jìn)行表面修飾和功能化，增加疏水性稀土摻雜納米顆粒的親水性。

研究表明，通過(guò)二氧化硅包覆、配體交換、配體氧化、配體吸引、層層自組裝以及配體剝離等幾種表面修飾方法，如圖2所示，可以制備具有良好生物相容性的親水性納米材料，從而進(jìn)一步拓寬TRFIA的應用領(lǐng)域。

1.3其他材料

量子點(diǎn)(quantumdots,QDs)是一種尺寸約為1～10nm的光致發(fā)光半導體納米晶體，具有激發(fā)光譜寬且連續分布、發(fā)射光譜窄而對稱(chēng)、斯托克斯位移較大、光化學(xué)穩定性高、熒光壽命長(cháng)等優(yōu)越的熒光特性，是一種理想的熒光探針。Chen等開(kāi)發(fā)了一種基于熒光共振能量轉移(FRET)的均相時(shí)間分辨熒光免疫分析定量檢測癌胚抗原(CEA)的方法，將成功制備的鋱螯合物和谷胱甘肽修飾的硒化鎘/硫化鋅(CdSe/ZnS)量子點(diǎn)分別與不同的抗CEA單克隆抗體(McAb)結合，在雙抗體夾心模式下，利用時(shí)間分辨熒光檢測儀在量子點(diǎn)發(fā)射峰(565nm)外檢測到與CEA濃度成正比的熒光強度，并與CEA濃度成正比。該方法操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)較短、靈敏度高，制備的水溶性量子點(diǎn)的光學(xué)性質(zhì)適合于均相免疫分析，作為一種熒光材料，可以進(jìn)一步應用于臨床檢測。

含稀土配合物的熒光聚合物微球結合微球的比表面積大、表面易功能化優(yōu)點(diǎn)和稀土配合物極寬的斯托克斯位移和超長(cháng)熒光壽命(約0.5ms)的特性，在時(shí)間分辨熒光分析方面也得到了很好的應用。

2TRFIA在免疫分析中的應用

2.1TRFIA在免疫診斷中的應用

免疫診斷是應用免疫學(xué)的理論、技術(shù)和方法診斷各種疾病以及測定免疫狀態(tài)，常用技術(shù)包括放射免疫、酶聯(lián)免疫、化學(xué)發(fā)光等。TRFIA憑借其靈敏度高、特異性強、簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)點(diǎn)，廣泛應用于傳染病診斷、腫瘤標志物檢測以及其它臨床疾病的診斷(表1)。