沙門(mén)菌(Salmonella)病又被稱(chēng)為副傷寒，是一種在皮毛小動(dòng)物飼養全過(guò)程常用的急性傳染病，常發(fā)于6—8月，呈地區性時(shí)興，關(guān)鍵表現癥狀為發(fā)燙，下痢拉肚子，體重下降，發(fā)生腦出血癥狀，小產(chǎn)等。美國、荷蘭、澳大利亞等國均有北美水貂(Mustelavison)感柒沙門(mén)菌生病的報導，中國，在中國河北省、東北三省、山東省等地域也是有有關(guān)病例報道?，F階段，沙門(mén)菌的防止與醫治以抗生素藥物為主導。近些年對沙門(mén)菌的抗藥性科學(xué)研究數據顯示，人源、小動(dòng)物源沙門(mén)菌的多重耐藥狀況和耐藥性水平日益增長(cháng)，并根據飲用水和食品等方法在動(dòng)物和人中間持續傳送?？咕仡?lèi)藥物濫用，給病菌導致挑選工作壓力是導致多重耐藥狀況日益比較嚴重的首要緣由之一，因而，在養殖業(yè)中有效運用醫治動(dòng)物疾病至關(guān)重要。

為調研秦皇島市地域北美水貂沙門(mén)菌的診斷率及耐藥性狀況，對65份水貂試品中的病菌開(kāi)展分離純化，選用病菌的評定塑造、革蘭氏染色、生物化學(xué)評定和16SrDNA評定分離出來(lái)菌，選用小白鼠高致病實(shí)驗科學(xué)研究分離出來(lái)菌種的高致病，選用KB紙條法檢驗分離出來(lái)菌的抗藥性。數據顯示，經(jīng)評定總共分離出來(lái)出9株沙門(mén)菌，分離出來(lái)率13.85%(9/65)；9株沙門(mén)菌均可致小白鼠病發(fā)身亡，致死率20%—100%；9株沙門(mén)菌各自對5—11種抗生素藥物耐藥性，氟苯尼考、替米考星、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和復方新諾明的耐藥性率達到100%，土霉素比較敏感率最大，為88.89%(8/9)。以上科學(xué)研究結果顯示，秦皇島市地域從水貂分離出來(lái)到的沙門(mén)菌均具備一定的發(fā)病力和多重耐藥性，為該地域水貂沙門(mén)氏菌病的預防給予參照。

文中對2019年秦皇島市地域復檢北美水貂的沙門(mén)菌帶上狀況開(kāi)展調研，并對分離出來(lái)菌種的致病和抗藥性開(kāi)展科學(xué)研究，致力于為該地域北美水貂沙門(mén)氏菌病的預防給出的數據適用。

1原材料與方式

1.1試品

2019年3—9月搜集秦皇島市地域病亡北美水貂病料65份，30—180日齡不一。

1.2關(guān)鍵實(shí)驗試劑

H.E.瓊脂粉培養液購自青島海博生物公司；革蘭氏染色液購自京博創(chuàng )脈達高新科技有限責任公司；ID32E腸桿菌科和其它非苛養革蘭氏陽(yáng)性菌呈陰性鏈球菌評定實(shí)驗試劑條購自法國的貝克曼庫爾特企業(yè)；D2000plusDNAladder，購自中科瑞泰科技有限責任公司；2×TaqMasterMix，病菌DNA基因獲取檢測試劑盒，膠回收利用檢測試劑盒購自康為世紀生物技術(shù)有限責任公司；pMD19-T媒介，購自寶日醫(TaKaRa)生物科技有限責任公司；藥敏試驗紙條購自杭州市天宇微生物菌種科技發(fā)展有限責任公司；編碼序列測量服務(wù)項目由上海生工生物技術(shù)企業(yè)給予。昆明市小白鼠(休重20±5g)購自北京市維通利華實(shí)驗小動(dòng)物有限責任公司。

1.3引物設計

病菌16SrDNA評定通用引物由上海生工生物技術(shù)企業(yè)生成。引物設計編碼序列為27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R:TACGGYTACCTTGTTACGACTT。

1.4病菌的分離純化

無(wú)菌檢測采用病亡水貂肝部、肝臟、心血管，于潔凈臺中注射于H.E.瓊脂粉培養液，放置37℃恒溫培養箱中塑造18—24h，挑菌黑綠色且核心有小黑點(diǎn)的菌體再次于H.E.培養液中劃線(xiàn)提純塑造18—24h，挑菌合乎以上特點(diǎn)的單菌體注射于LB培養基中，放置37℃振蕩培養箱塑造18—24h。

1.五分離菌的革蘭氏染色

挑菌提純后的單菌體開(kāi)展革蘭氏染色，上色實(shí)際操作依照實(shí)驗試劑使用說(shuō)明開(kāi)展，上色后在顯微鏡下觀(guān)查病菌的上色特點(diǎn)和形狀。

1.六分離菌的生物化學(xué)評定

生物化學(xué)評定實(shí)驗參考ID32E腸桿菌科和其它非苛養革蘭氏陽(yáng)性菌呈陰性鏈球菌評定實(shí)驗試劑條開(kāi)展，用ATB全自動(dòng)生物化學(xué)評定對系統結果判斷。

1.7分離出來(lái)菌的16SrDNA評定

依照病菌DNA基因獲取檢測試劑盒使用說(shuō)明獲取分離出來(lái)菌的DNA做為PCR模版。PCR管理體系為：上、中下游引物設計和模版各1μL，ddH2O22μL，2×TaqMasterMix25μL，總容積為50μL。PCR擴增反映程序流程為：94℃預轉性5min；94℃轉性30s，55℃淬火30s，72℃拓寬60s，共30個(gè)循環(huán)系統；72℃拓寬10min。用膠回收利用檢測試劑盒回收利用1500bp上下雜帶，回收利用物質(zhì)聯(lián)接pMD19-T媒介并轉到DH5α感受態(tài)細胞，施膠于帶有氨芐青霉素的LB瓊脂粉培養液塑造，挑菌陽(yáng)性菌落放置含氨芐青霉素的LB培養基中繁衍塑造，送上海生工生物技術(shù)企業(yè)轉錄組測序。轉錄組測序結果在NCBI的BLAST系統分區查找并核對剖析。

1.8分離出來(lái)菌的高致病實(shí)驗

論文參考文獻中的使用量與方式，每棵分離出來(lái)菌各自感柒5只小白鼠，每只小白鼠腹部注入0.2mL用高壓滅菌后的PBS調節濃度值后的菌液(濃度值1×108cfu/mL)，設定對照實(shí)驗一組，每只小白鼠注入0.2mL的無(wú)菌檢測PBS，其他標準與分離出來(lái)菌感柒組同樣。觀(guān)查并紀錄小白鼠身亡病發(fā)狀況。

1.9分離出來(lái)菌的藥品敏感實(shí)驗

依照英國臨床醫學(xué)和實(shí)驗室規范研究會(huì )(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，CLSI)規范的操作方法和判準，選用KB紙條法檢驗分離出來(lái)菌對β-內酰胺類(lèi)(氨芐西林、頭孢曲松鈉、阿莫西林膠囊)，氨基糖苷類(lèi)(阿米卡星、新霉素、卡那霉素)，四環(huán)素類(lèi)(鹽酸多西環(huán)素、土霉素)，氟喹諾酮類(lèi)(環(huán)丙沙星、恩諾沙星)，氯霉素類(lèi)(氟苯尼考)，大環(huán)內酯(替米考星)，磺胺類(lèi)(磺胺間甲氧、磺胺二甲氧、復方新諾明)，總共15種抗菌素的敏感度。

2結果

2.1病菌的分離純化

從65份樣本中總共分離出來(lái)出9株疑是沙門(mén)菌的菌種。疑是菌種在H.E.瓊脂粉培養液塑造菌體正圓形，邊沿齊整，微突，深藍色，菌體正中間有小黑點(diǎn)(圖1A)。

2.2分離菌的革蘭氏染色

經(jīng)革蘭氏染色，9株分離出來(lái)菌均為革蘭氏陽(yáng)性菌呈陰性短鏈球菌，兩邊鈍圓(圖1B)。