細菌黑色素是天然色素的主要來(lái)源于，具備與眾不同的制造優(yōu)點(diǎn)和生物活性，關(guān)鍵有紅、黃、藍三大色調。相對性于鮮紅色黑色素，細菌淡黃色黑色素的類(lèi)型較少，但在食品類(lèi)、護膚品等領(lǐng)域有著(zhù)廣泛的行業(yè)前景?，F階段已發(fā)覺(jué)產(chǎn)淡黃色黑色素的細菌關(guān)鍵有(1)紅曲霉屬(Monascusspp)造成萘醌類(lèi)紅曲黃色素，并已商業(yè)化的生產(chǎn)制造；(2)曲霉屬(Aspergillus)A．cristatus和A．xavus造成甲基萘醌類(lèi)黃色素；(3)青霉屬Penicilliumcitreonigrum造成黃色素；(4)散囊菌屬Eurotiumrubrum代謝萘醌類(lèi)黃棕色黑色素。而Simplicillium屬細菌造成的黑色素則末見(jiàn)報導。

本試驗室從藍藻細胞培養液中分離出來(lái)出一株相互依存細菌Simpliciiliumlanosoniveum(DT06)。該細菌在沙氏培養液中生成一種新的抗菌素、胞外含糖量和少量的黑色素，而在含碳量無(wú)機物培養液中則很多生成黃色素(DT06黑色素)，這也是第一次發(fā)覺(jué)Simplicillium屬的細菌可以生成黑色素。文中對DT06黑色素開(kāi)展分離純化、表現，科學(xué)研究其抗氧化和可靠性，并選用Plackett—Burman和響應面設計方案，對其發(fā)醇培養液成份開(kāi)展提升，為該黑色素的進(jìn)一步運用打下基礎。

一、原材料與方式

1、原材料

（1）菌苗與培養液

細菌DT06(Simplicilliumlanosoniveum)由河北工業(yè)高校代謝工程試驗室分離出來(lái)，現儲藏在中科院微生物菌種研究室菌物標本館，儲藏序號HMAS242045。PDA培養液(1L)：土豆200g，葡萄糖水20g，瓊脂粉15g，pH當然。

改進(jìn)BG-11培養液(1L)：NaNO₃0.76g，K₂HP0₄0.48g，MgS0₄·7H₂0O.075g，CaCl₂·2H₂00.036g，葡萄糖水18g，Criticacidstock(CS)10mL，Tracemetalmix(TM)lmL，pH當然。

（2）原材料、儀器設備與機器設備

2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二氨鹽(ABTS)、1，1-二苯基-2-三磺酰氯肼(DPPH)：南京市奧多福尼生物技術(shù)有限責任公司；別的分析純化工品均購自南開(kāi)大學(xué)科威企業(yè)。

Agilent-1200高效率液相色譜：英國Agilent企業(yè)；CARy300型紫外線(xiàn)光譜儀：上海精科儀器廠(chǎng)；RE-5205旋轉蒸發(fā)器：上海亞榮生物化學(xué)儀器廠(chǎng)。

2、方式

（1）發(fā)醇方式

將4℃儲藏的細菌DT06注射于PDA斜坡培養液上，25℃塑造5d，無(wú)菌檢測情況下配置成胞子混液，注射于100／250mLBG-11培養液中，在25℃、130r／min標準下?lián)u床塑造36h做成種籽液，以l％的接種量把種籽液接轉到80／250mL改進(jìn)BG-11培養液中，在同樣情況下?lián)u床塑造7d。

（2）黑色素的剝離與提純

將發(fā)酵物在8000r／min標準下離心式10min，去除菌絲，搜集上清液。500mL上清液中添加300mL硫酸堿化的乙酸丁酯，充足波動(dòng)，靜放取頂層乙酸丁酯提取液。滲瀝液低電壓水蒸氣蒸餾去除乙酸丁酯，獲得的黑色素用工業(yè)甲醇融解，再用0．22μm濾紙過(guò)慮，獲得高純工業(yè)甲醇黑色素水溶液。

（3）黑色素的色譜及成分計算方式

將獲得的高純黑色素水溶液用適當工業(yè)甲醇稀釋液，用紫外線(xiàn)-由此可見(jiàn)光度計開(kāi)展全股票波段掃描儀(200～800nm)，以明確較大消化吸收光波長(cháng)。

選用Agilent-1200高效率液相色譜開(kāi)展剖析，色譜儀標準：C18(Kromasil)離子交換柱(250mm×4．6mm，5μm)；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：25℃，紫外線(xiàn)-能見(jiàn)光探測器。在以上情況下檢驗DT06黑色素的最好流動(dòng)性相及流動(dòng)速度。

在色素沉著(zhù)的最高消化吸收光波長(cháng)下，用OD值值表明黑色素成分，黑色素成分表明為較大消化吸收光波長(cháng)下1ml回應發(fā)酵物的OD值值。

（4）黑色素的清除自由基活力

各自測量細菌DT06黑色素對DPPH氧自由基、ABTS氧自由基、超氧自由基和羥基自由基的清理工作能力。DPPH氧自由基、ABTS氧自由基和超氧自由基的清除率計算方法為：[1-(A₁-A₂)／A₀]×100；羥基自由基清除率計算方法為：(A₁-A₀)／(A₂-A₀)×100，在其中A₁、A₂和A₀各自為對照組、對照實(shí)驗和空缺組的吸光度值。同樣情況下，用等濃度值的維他命C做陽(yáng)性對照。

（5）黑色素的可靠性

各自取一定量的黑色素水溶液于具塞試管嬰兒中，科學(xué)研究不一樣溫度(4、20、40、60、80、100℃)、陽(yáng)光照射(黑喑、陽(yáng)光照射、紫外線(xiàn)、12000LX)、pH(2、4、6、8、10)對其穩定的危害，每24h抽樣一次，用280nm處的OD值值表明黑色素成分。

（6）培養液各成分的提升

在BG-11培養液的根基上，運用Plackett-Burman(PB)試驗設計，科學(xué)研究葡萄糖水(X₁)、NaN0₃(X₂)、K₂HP0₄(X₃)、MgS0₄·7H₂0(X₄)、CaCl₂‘2H₂0(X₅)、CS(X₆)、TM(X₇)對細菌DT06生產(chǎn)制造黑色素(Y)的危害，在PB實(shí)驗方案設計結果的根基上，用Box-Behnken設計方案(BBD)開(kāi)展響應面提升。

二、結果與探討

1、黑色素的色譜

堿化的乙酸丁酯提取液經(jīng)蒸餾、工業(yè)甲醇復溶獲得高純黑色素水溶液，呈淡黃色(圖1)。DT06黑色素能溶解于水，有別于A(yíng)．cristatus產(chǎn)的黃色素。黑色素甲醇溶液的紫外線(xiàn)由此可見(jiàn)掃描儀光譜儀如圖所示2a所顯示，在285nm上有特點(diǎn)消化吸收峰，與P．citreonigrum和E．rubrum黃色素各自在330nm和396nm處的特點(diǎn)消化吸收峰不一樣，285nm能夠 做為檢驗光波長(cháng)用以高效液相色譜色譜和黑色素成分測量。
 

依據著(zhù)色劑的正負和離子交換柱的類(lèi)型來(lái)挑選適宜的流動(dòng)性相和流動(dòng)速度，最后明確當流動(dòng)性相為乙腈：水(2:8，V/V)、流動(dòng)速度為0.8mL／min時(shí)離子交換柱對黑色素的分離出來(lái)實(shí)際效果最好是，如圖所示2b所顯示，在10.52min上下發(fā)生單一峰(7.84min為工業(yè)甲醇有機溶劑峰)，峰形險峻、對稱(chēng)優(yōu)良，說(shuō)明黑色素純凈度較高。