肉食品中傷害最大的細菌是瘦臉針梭狀枯草芽孢菌通稱(chēng)肉毒梭菌，該菌在厭氧發(fā)酵環(huán)鏡中可造成肉毒毒素，肉毒毒素毒副作用比氰化鉀強一萬(wàn)倍。因為肉毒梭菌造成的肉毒毒素的有毒毒副作用，世界各地都容許肉毒梭菌緩聚劑一亞硝酸鈉做為食用添加劑在肉類(lèi)食品中限定應用。亞硝酸鈉在肉類(lèi)食品中能夠顯著(zhù)抑止瘦臉針梭狀枯草芽孢菌造成內毒素?？墒墙鼛资陙?lái)，亞硝酸鈉已變成食品衛生安全異議的聚焦點(diǎn)。由于在一定情況下（例如高溫），肉食品中殘存的亞硝酸鈉能夠 與分散碳水化合物和丙烯胺反映，轉化成痕量元素N-亞硝酸。小動(dòng)物及臨床流行病學(xué)科學(xué)研究結果顯示N-亞硝酸是強致癌物質(zhì)。

次磷酸鈉能夠 控制革蘭氏陽(yáng)性綠膿桿菌（包含肉毒梭菌），可以處理肉食品產(chǎn)品質(zhì)量難點(diǎn)，而且中國次磷酸鈉生產(chǎn)工藝及水準持續提升 ，具有了生產(chǎn)制造食品級不銹鋼次磷酸鈉的工作能力，現階段早已到系統的、全方位的科學(xué)研究次磷酸鈉取代亞硝酸鈉的機會(huì )。次磷酸鈉是一種比較理想的工業(yè)級氧化劑，關(guān)鍵用以化學(xué)鍍鎳、電鍍工藝、有機化學(xué)工業(yè)生產(chǎn)、食品工業(yè)和冷藏、橡膠制品增稠劑。對于次磷酸鈉的殺菌作用，海外科研工作人員己經(jīng)開(kāi)始科學(xué)研究次磷酸鈉抑止肉毒梭菌的實(shí)際效果，嘗試做為亞硝酸鈉抗菌劑的替代品，獲得不錯進(jìn)度。Rhodehamel等覺(jué)得次磷酸鈉口感上很柔和，無(wú)刺激性味，對肉類(lèi)食品的顏色和抗氧化層面沒(méi)什么副作用，此外，次磷酸鈉是不確定性的一種好的抗菌劑，而且在1990年被審批為安全性化學(xué)物質(zhì)（GRAS）。Woodetal和PeggandShahidi試驗說(shuō)明，次磷酸鈉添加到肉漿中，針對肉毒菌素的抑止是合理的。

本科學(xué)研究用不一樣含量的次磷酸鈉（下稱(chēng)SHP）水溶液對肉食品中常用的六種有危害菌（生孢梭菌、脹氣莢膜梭、菌沙門(mén)菌、大腸埃希菌、橙黃色鏈球菌、蠟樣枯草芽孢菌）開(kāi)展抗菌解決，根據對照實(shí)驗與對照組抑菌圈尺寸比照，分辨SHP對六種菌的抗菌實(shí)際效果；并且以有抗菌實(shí)際效果的菌苗為研究對象，探尋SHP的最少抗菌濃度值；進(jìn)一步探索SHP抑止肉毒梭菌的最好抗菌標準。

依據《病原微生物實(shí)驗室生物安全管理條例》歸類(lèi)標準，瘦臉針梭狀枯草芽孢菌歸屬于試驗室二級毒副作用菌，為高致病微生物，對科學(xué)研究工作人員的生命安全有一定威協(xié)，不宜試驗室工作人員立即科學(xué)研究，因為生孢梭菌的危險較小，而且其特性特點(diǎn)與肉毒梭菌極為類(lèi)似，因此 許多專(zhuān)家教授用生孢梭菌替代肉毒梭菌開(kāi)展科學(xué)研究。因而，本畢業(yè)論文全部實(shí)驗均以肉毒梭菌的科學(xué)研究取代菌生孢梭菌來(lái)進(jìn)行科學(xué)研究。

一、原材料與方式

1、原材料與實(shí)驗試劑

次磷酸鈉（SHP）：純凈度≥99.8％，阿拉丁有限責任公司；生孢梭菌CICC（10385）干凍粉、脹氣莢膜梭菌CICC（22949）干凍粉、蠟樣枯草芽孢菌CMCC（B）63301干凍粉；

大腸埃希菌0157（EPEC）、沙門(mén)菌（阿貢納）、橙黃色鏈球菌ATCC（6538）、純凈水、液體石蠟、厭氧發(fā)酵帶；

加強梭菌培養液、PCA、LB骨頭湯培養液、加強梭菌瓊脂粉；

碳酸鈉AR。

2、儀器設備與機器設備

超凈工作臺、恒溫箱、電冰箱、厭氧罐、光度計。

3、實(shí)驗方法

（1）SHP梯度方向液的配置

抗菌實(shí)際效果試驗SHP水溶液配置：

取七個(gè)500mL容量瓶清洗殺菌，各自型號1～7。各自配置0mg/L、250mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L、3000mg/L、4000mg/L規范SHP水溶液，混勻。取7支整潔已殺菌試管嬰兒在無(wú)菌車(chē)間中每一個(gè)試管嬰兒各自放入不一樣含量的SHP水溶液10mL，型號，橡膠塞殺菌塞緊，預留，切勿將水溶液先裝進(jìn)試管嬰兒隨后變道殺菌。最少抗菌濃度值探尋SHP水溶液配置：

跟上面一樣解決方式各自配置0mg/L、2000mg/L、2200mg/L、2400mg/L、2600mg/L、2800mg/L、3000mg/L規范SHP水溶液。

（2）培養液的配置

加強梭菌培養液：稱(chēng)量本產(chǎn)品38.0g，加溫拌和融解于1000mL純凈水中，散裝多個(gè)試管嬰兒中10mL，滴進(jìn)適當液體石蠟封閉式液位，變道后121℃高壓滅菌15min，預留。

LB骨頭湯培養液、PCA、加強梭菌瓊脂粉：按表明稱(chēng)量相對應本產(chǎn)品，加溫拌和融解于1000mL純凈水中，散裝10個(gè)三角瓶中，121℃高壓滅菌15min，預留。

（3）菌種活化與菌液配置

生孢梭菌、脹氣莢膜梭菌：超凈工作臺中，用燒紅制冷的接種環(huán)將菌苗連接加強梭菌培養液試管嬰兒中活性24h；依照GB測菌落總數，將原菌液適度稀釋液操縱菌液濃度值大約在105上下。

沙門(mén)菌、大腸埃希菌、橙黃色鏈球菌、蠟樣枯草芽孢菌：超凈工作臺選用燒紅制冷的接種環(huán)將菌苗連接裝有10mLLB的三角瓶中活性24h；依照GB測菌落總數（大約在2.37×108），將原菌液適度稀釋液操縱菌液濃度值大約在106上下。

（4）抑菌圈的測量

生孢梭菌、脹氣莢膜梭菌抑菌圈的測量：

殺菌夾層玻璃培養皿底端區劃地區并序號1～7→倒平板每一個(gè)培養皿20mL→每一個(gè)平板電腦加100μL菌液施膠勻稱(chēng)一每一個(gè)地區中間放上一個(gè)殺菌的牛津杯一每一個(gè)牛津杯里添加200μL相匹配序號的SHP水溶液一蓋好外蓋后放進(jìn)厭氧罐中并放進(jìn)厭氧發(fā)酵帶一封好厭氧罐外蓋移進(jìn)恒溫箱。做多個(gè)平行面試驗，36℃下塑造24h，精確測量抑菌圈。

大腸埃希菌、沙門(mén)菌、橙黃色鏈球菌、蠟樣枯草芽孢菌抑菌圈的測量：殺菌夾層玻璃培養皿底端區劃地區序號1～7→移液器汲取1mL菌液各自進(jìn)入到培養皿中→加溫溶化PCA制冷至40～50℃倒平板→每一個(gè)地區中間放上一個(gè)殺菌的牛津杯→每一個(gè)牛津杯里用移液器添加200μL相匹配序號的SHP水溶液→蓋好外蓋移進(jìn)恒溫箱。做多個(gè)平行面試驗，36℃下塑造24h，精確測量抑菌圈。

（5）SHP對肉毒梭菌、脹氣莢膜梭菌最少抗菌濃度值的測量

活性后原菌液混勻→散裝到7支試管嬰兒中每一個(gè)100μL一各自添加1～花了7天時(shí)間SHP水溶液lOmL→混勻滴進(jìn)適當液體石蠟封閉式，36℃下塑造24h→取7支殺菌整潔比色皿→各自添加1～花了7天時(shí)間菌液（混勻）→600nm下測其OD值明確MIC。

（6）生孢梭菌的最好抑止標準測量

SHP對身孢梭菌抑止關(guān)鍵受溫度、時(shí)間、pH要素的危害，挑選L9（34）正交實(shí)驗，方案設計如下所示。

取9個(gè)殺菌整潔夾層玻璃培養皿各自序號1～9→倒平板每一個(gè)培養皿20mL→用移液器每一個(gè)平板電腦加IOOμL菌液于培養液表層涂抹勻稱(chēng)→每一個(gè)培養皿里放上三個(gè)殺菌的牛津杯→每一個(gè)牛津杯里添加相對應pH的SHP水溶液200μL蓋好外蓋→放進(jìn)厭氧罐中開(kāi)啟厭氧發(fā)酵袋封住外蓋→同一塑造溫度的對照組移進(jìn)相匹配的恒溫箱→精確測量各對照組抑菌圈直徑尺寸，照相，紀錄，數據分析。對檢測結果開(kāi)展數據分析，找到最好組成，進(jìn)而明確SHP對身孢梭菌的最好抑止標準。

（7）數據信息數據分析

每一組試驗反復3次測量，選用SPSSl9.0統計分析軟件對信息完成數據分析及顯著(zhù)性分析，數據信息選用標準偏差表明。

二、結果與探討

1、SHP對肉食品中的普遍有危害菌的抗菌實(shí)際效果

本分析挑選肉食品中常用的傷害菌，包含革蘭氏陽(yáng)性菌、脹氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、橙黃色鏈球菌、蠟樣枯草芽孢菌；革蘭氏陽(yáng)性菌陰性菌：沙門(mén)菌、腸子埃希氏菌，科學(xué)研究次磷酸鈉對每一種病菌是不是有控制實(shí)際效果。不一樣含量的SHP對肉食品中的六種有危害菌開(kāi)展解決，選用牛津杯法，見(jiàn)圖1，仔細觀(guān)察抑菌圈的形成狀況來(lái)判斷SHP對六種菌的抗菌實(shí)際效果，及其隨SHP濃度值轉變的抗菌發(fā)展趨勢。抑菌圈的尺寸展現了SHP抗菌實(shí)際效果的高低，抑菌圈越大表明SHP的抗菌作用越好。

圖1中，牛津杯的外直徑為8.0mm。下列實(shí)驗中解決的試品要是沒(méi)有超過(guò)8.00mm的清楚的抑菌圈，視作沒(méi)有殺菌作用。